AEG―I表达对宫颈癌SiHa细胞周期的影响及相关分子机制研究

摘要： 目的：探讨AEG-I表达的变化对宫颈癌SiHa细胞周期性的影响以及影响的相关分子机制。方法：使用western blotting对宫颈鳞癌组织、宫颈鳞癌SiHa细胞、以及正常宫颈组织中的AEG-1蛋白的表达进行检测，分析三组样品中的AEG-1蛋白表达差异。结果：正常宫颈组织的AEG-1蛋白表达量显著低于宫颈鳞癌组织中的蛋白表达量（P<0.05）;SiHa细胞中的AEG-1蛋白表达量显著高于对照细胞中AEG-1蛋白表达量（P<0.05）。此外，AEG-1-siRNA对SiHa细胞中AEG-1表达有显著地下调作用（P<0.05）;AEG-1表达的下调可以显著增加SiHa细胞在G0/G1期的数量（P<0.05）。且AEG-1-siRNA组细胞中cyclin D1以及CDK2等蛋白的表达显著低于对照siRNA组（P<0.05）。结论：AEG-1在宫颈鳞癌组织以及细胞中有较高的表达，该蛋白的高表达显著影响了SiHa的周期，使其在G0/G1期比例显著增加，该现象的分子机制可能与cyclin D1以及CDK2的表达下调有相关性。

关键词：星形细胞上调基因-1;宫颈癌;细胞周期;小干扰核酸;分子机制

宫颈癌常见为鳞状细胞癌，其是临床多发的女性生殖系统恶性肿瘤。其复发以及转移成为了导致患者死亡的重要因素之一。这个复杂的过程是由一系列基因调控系统所组成。星形细胞上调基因1（astrocyte elevated gene-1，AEG-1）最初是通过人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）和肿瘤坏死因子α诱导人星形细胞发现的一种新型蛋白。近年来的研究表明[1]，AEG-1与肿瘤的发生和发展密切相关，在唾液腺癌、原发性胆囊癌、卵巢癌和乳腺癌等中发现AEG-1的表达异常升高。有研究显示[2]，AEG-1在宫颈癌组织中的表达也显著高于正常组织，提示AEG-1可能在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用，但其分子机制尚需探讨。本研究对siRNA介导的AEG-1表达沉默的SiHa细胞的周期性变化进行研究，并对其发生的分子机制进行探讨，现将结果报道如下。

方法：

1， 细胞培养以及转染：细胞培养和转染：SiHa细胞复苏后，置含5%胎牛血清的DMED培养基中。达到85%一95%细胞融合度时，以siRNA和AEG-l-siRNA转染SiHa细胞。转染后将细胞分为3组：未转染组（不作任何处理）、siRNA对照组和AEG-1-siRNA转染组。

2， western blotting测定蛋白表达：裂解细胞（细胞数1×107加100 μl lysis buffer），根据样品蛋白浓度，按蛋白总量50μg计算体积。SDS-PAGE垂直电泳200 V 90 min，100 V湿法转膜。分别结合I抗（AEG-1抗体，cyclin D1、CDK2、β-actin抗体），4℃过夜。TBS/T清洗5 min *3遍后，结合Ⅱ抗（HRP―la-beled羊抗兔IgG，羊抗鼠IgG抗体），室温1 h，温和振荡。TBS/T振荡清洗5 min * 3遍。至暗房，加ECL显色液作用1 min，感光、洗片。实验重复三次。

3， 流式细胞仪检测SiHa细胞周期：收集转染后48 h的SiHa细胞（每组约1x 106个），以磷酸采用流式细胞仪检测样品DNA含量。

4， 统计学分析：采用SPSS17.0统计分析软件对研究数据进行统计分析，计量资料之间的比较使用t检验进行分析，统计结果以P<0.05为差异具有统计学意义。

结果：

正常宫颈组织的AEG-1蛋白表达量显著低于宫颈鳞癌组织中的蛋白表达量（P<0.05）;SiHa细胞中的AEG-1蛋白表达量显著高于对照细胞中AEG-1蛋白表达量（P<0.05）。具体结果如下图所示。

N：正常组织;T：宫颈癌组织;NC：正常细胞

AEG-1-siRNA对SiHa细胞中AEG-1表达有显著地下调作用（P<0.05），AEG-1-siRNA转染组SiHa细胞中AEG-1表达量显著低于未转染组以及对照siRNA转染组（P<0.05）。具体结果如下图所示。

AEG-1表达的下调可以显著增加SiHa细胞在G0/G1期的数量（P<0.05）。AEG-1-siRNA组SiHa细胞在G0/G1期的比例显著高于未转染组以及对照siRNA转染组（P<0.05）。AEG-1-siRNA组SiHa细胞在S期的比例显著低于未转染组以及对照siRNA转染组（P<0.05）。具体数据如下表所示。

表1，AEG-1表达量对细胞周期的影响分析

且AEG-1-siRNA组细胞中cyclin D1以及CDK2等蛋白的表达显著低于对照siRNA组（P<0.05）。

讨论：

研究发现，AEG-1可以激活肿瘤细胞增殖途径并且减少肿瘤细胞凋亡，因此可以促进其增殖。在乳腺恶性肿瘤和前列腺恶性肿瘤的相关临床研究中发现，细胞周期抑制因子表达的下调有可能与AEG-1表达的上调有因果关系，这些变化可以促进细胞增殖。此外，有研究表明[5]，在神经母细胞肿瘤中，抑制AEG-1表达可以引起细胞周期停滞在G0/G1期，抑制细胞分裂增殖。现利用流式细胞术进行进一步研究分析，观察转染前后SiHa细胞周期分布的变化，结果显示AEG-1 siRNA组中停滞在G0/G1 期的SiHa细胞比率大大高于对照siRNA组和未作任何处理组，而且S期细胞的比率也比对照siRNA组和未作任何处理组于要高，这一结果显示AEG-1表达下调可以诱导细胞周期停滞在G0 /G1期，进而可以降低宫颈恶性肿瘤细胞的增殖。深入研究分析表明[6]，AEG-1 siRNA转染后，与细胞分裂增殖关系较密切的cdk2和cyclin D1蛋白的表达也出现明显降低，这表明AEG-1诱导出现的宫颈恶性肿瘤细胞周期静止现象可能与cdk2和cyclin D1蛋白表达降低有密切的关系。

本研究结果表明，AEG-1在宫颈鳞癌组织以及细胞中有较高的表达，该蛋白的高表达显著影响了SiHa的周期，使其在G0/G1期比例显著增加，该现象的分子机制可能与cyclin D1以及CDK2的表达下调有相关性。

参考文献：

[1] 梁紫影，张兆祥援 星形胶质细胞上调基因-1（AEG-1）与肿瘤[J] 临床与实验病理学杂志，2011，27（3）：297-300

[2] Brown D M， Ruoslahti E. Metadherin， a cell surface protein in breast tumors that mediates lung metastasis[J]. Cancer cell， 2004， 5（4）： 365-374.

[3] 崔晓峰，刘爱军，韦立新，等.细胞周期蛋白Gl在喉鳞状细胞癌中的表达及其临床病理学意义.中华病理学杂志，2008，37（3）：165―168.