胃癌中p16基因甲基化及其与胃癌临床病理特征的关系

摘要：目的：检测胃癌(GC)p16基因的启动子CpG岛甲基化状态，探讨p16基因甲基化在胃癌发生发展中的作用及其与胃癌临床病理特征的关系。方法：应用甲基化特异性PCR(MSP)检测胃癌组织和正常胃粘膜组织p16基因的启动子CpG岛的甲基化状态。并对胃癌中p16基因的甲基化与临床病理特征之间的关系进行分析。结果：胃癌组织中p16基因的甲基化阳性率为56.8％，对照正常组织组中未发现p16基因甲基化，胃癌组p16基因甲基化阳性率显著高于对照组。且甲基化表达与GC患者的年龄、性别、肿瘤大小、部位及组织学类型无关，与病变的浸润深度、淋巴结转移和远处转移有关。结论：p16基因甲基化修饰在GC发生发展中起重要作用，可作为反映胃癌侵袭转移的生物学指标。

关键词：p16；遗传学；甲基化；胃癌

中图分类号：R735.2　文献标识码：A　文章编号：1008-2409(2011)03-0254-04

研究发现胃癌的发生发展是一个复杂的多阶段过程，胃癌和其他肿瘤一样是多基因病，是多种相关基因发生失常的结果。最近研究表明：p16基因是个候选肿瘤抑制基因，其基冈改变、转录异常和表达丢失与肿瘤的发生发展存在着密切的关系。遗传学的研究表明，胃癌的形成常常伴随着抑癌基因肩动子区域CpG岛的异常甲基化修饰。本研究采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测了p16基因启动子区在胃癌组织中的甲基化状况，现分析如下。

1对象与方法

1.1对象选择

2006年1月至2009年10月在我院腔镜中心胃镜检查并经手术及病理证实为GC的患者74例，男46例，女28例；年龄36～87岁，平均58.5岁；高分化胃癌18例，中分化胃癌21例，低分化胃癌35例；肿瘤直径小于5cm53例，大于5cm21例；部位：贲门胃底11例，胃体26例，胃窦37例；所有病例取材前均未进行抗肿瘤治疗，所有患者均取病变组织和正常胃粘膜组织各1份，样本离体后30 min内均迅速放置于一80℃冰箱中。临床病理学分期采用国际抗癌联盟1997修订的TNM分期标准，其中I期19例，Ⅱ期13例，Ⅲ期20例，Ⅳ期22例。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取参照大连TaKaRa公司试剂盒说明书进行，提取产物用美国Bio-Rad公司Smart Spee plus核酸测定仪检测DNA的浓度和纯度，如OD260／OD280在1.6～1.8之间则置于-20℃的冰箱备用。

1.2.2亚硫酸氢盐修饰

参照美国Epigentek公司产品说明书进行。

1.2.3PCR将已修饰的DNA，分别用甲基化特异性引物和非甲基化特异性引物进行PCR，p16基冈引物设讣参照文献。PCR反应体系的构成：Taq酶0.5υl，模板DNA 2.5 ng，上游引物(20 υmol／L)lυl，下游引物(20 υmol／L)lυl，GCBuffer I 25 υI，dNTP(含Mg2+)8υ1，灭菌蒸馏水加至50υl，引物和扩增参数见表1。PCR产物行4％琼脂糖电泳(80 V，100 min)，结果经美国Bio-Rad公司Gel DoeTM XR凝胶成像系统进行分析，详见表1。

1.3统计学分析

应用统计分析软件SPSS13.0进行x2检验或者Fisher精确检验，判定标准：P

2结果

2.1p16基因的甲基化状态

74例胃癌组织中p16基因启动子区甲基化阳性为42例，检出率为56.8％，完全甲基化10例(图1)。配对正常组织中未发现p16基因甲基化，胃癌组织与正常对照组织基因甲基化检出率比较，差异有统计学意义(P

2.2p16基因甲基化与胃癌临床病理特征的关系

统计学分析显示，p16基因甲基化与胃癌患者年龄、性别、肿瘤大小、部位及组织学类型无关(P>0.05)，与病变的浸润程度、淋巴结转移和远处转移有关(P

3讨论

表观遗传学的研究表明，肿瘤的形成往往伴随着抑癌基因启动子区域CpG岛的异常甲基化修饰，即DNA的CpG岛的胞嘧啶被甲基化，常位于基因5’端启动子区，是DNA在转录水平上的修饰方式之一。甲基化通过两种机制参与转录调控：①DNA甲基化直接干扰了特异性结合蛋白与该识别序列的结合；②组蛋白去乙酰化酶或组蛋白甲基化转移酶与甲基化位点上的结合蛋白形成牢固、紧缩的核小体结构，间接的抑制基因的表达。

p16基因位于人类染色体9p21区，其主要作用是在“cyclinDl-CDK4／CDK6-PRb-E2F”环路中起负反馈调节作用，在细胞增殖过程中起检查点的作用，p16基因的任何变异都会导致上述环路无限制地进行，细胞过度增殖，使G1期未充分发育的细胞提前进入S期，导致癌症发生嘲。p16基因甲基化现象频繁出现于肺癌、肝癌和结肠癌等各种不同的癌标本及肿瘤细胞株中，该基因甲基化可能是导致p16表达下调或无表达的主要原因之一。MSP结果显示：p16基因在正常胃粘膜组织均未出现甲基化阳性片断，但在74例胃癌组织中有42例发生甲基化，检出率为56.8％，与以往报道相似。Mitsuno M等在研究应用5-氟尿嘧啶(5-FU)辅助化疗术后胃癌患者时发现，在人选的6个抑癌基因即6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)／CHFR、错配修复基因(hMLHl)、p16、上皮钙粘蛋白(E-cadherin)和Runt相关转录因子3(Runx3)的甲基化状态中，使用5-FU后能有效降低p16基因甲基化阳性的胃癌患者的复发率，而在其他基因甲基化阳性的胃癌患者没有类似结果，可能原因是胃癌组织发生p16基因甲基化后，p16蛋白表达量减少，处于S期的癌细胞增加，较易吸收5-FU，从而促进5-FU对胃癌细胞的抑制作用。可见检测胃癌肿瘤组织中p16基因的甲基化，可能为胃癌的术后治疗和患者预后评估提供理论依据。

本研究进一步分析p16基因甲基化表达与胃癌临床病理特征的关系，结果显示甲基化表达与GC患者的年龄、性别、肿瘤大小、部位及组织学类型无关(P>0.05)，与病变的浸润深度、淋巴结转移和远处转移有关(P

甲基化是一个可逆的过程。研究发现，在不表达p16的肿瘤细胞株中，用DNA甲基转移酶抑制剂DAB(5-aza-2’-deoxycytidine)和伊立替康(irinote-can)处理后基因表达恢复。因此，抑制和逆转抑癌基因甲基化的治疗可能成为胃癌治疗的新思路，具体的机制还有待于进一步研究。总之，我们认为对p16基因启动子进行甲基化检测，再结合胃镜、病理学以及一些实验室手段，有望提高胃癌的早期检出率，并且有可能成为临床判断胃癌患者预后的指标。在此基础上随着甲基化抑制因子去甲基化治疗的临床应用进一步发展，可能为胃癌的治疗开辟新途径。