小议生物反应器在软骨组织的研究进度

生物反应器可以控制和监测培养条件（如pH值、温度、压力、营养供应、废物清除等），是用来进行生物反应或生化反应的动态三维细胞培养装置[3]。与二维或静态培养方法相比，生物反应器具有诸多优势：①细胞培养周期短，无需多次换液；②通过各种机械刺激可增强种子细胞活性，诱导细胞分泌大量细胞外基质以紧密结合细胞支架；③生物反应器中形成的三维组织工程器官在各个方向上受力均匀，可减少传代扩增引起的细胞表型缺失[4]，增强抗压力负荷性能[5]。

1生物反应器中的生物物理因素

1.1氧浓度

氧气是软骨内环境稳态的重要因素，人关节软骨外表面所受的氧分压为7%～10%，关节内层软骨中的氧分压约为1%[6]。间质来源的软骨祖细胞凝集形成间质始基标志着软骨形成的开始，而该过程需要在一个相对低氧环境中进行。因此，氧气在软骨形成中的作用成为了研究热点。研究表明，当组织工程软骨处于低氧环境下，其表现的生化特性与自体软骨类似[7-9]。Meyer等[10]研究发现，在猪MSCs向软骨分化过程中，低氧浓度是比动态压力更有效的促分化剂。Schrobback等[11]深入研究了低氧浓度促进软骨生成的机制，即常氧状态下，低氧诱导因子2α（hypoxiainduciblefactor2α，HIF-2α）亚基在细胞质中稳定表达，而HIF-1α亚基在翻译后即被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶水解复合体降解，因此在正常氧饱和度下的细胞中基本检测不到HIF-1α亚基的表达；而在低氧状态下，HIF-1α亚基降解被抑制，1α和2α亚基形成有活性的HIF-1，HIF-1则转移至细胞核内调节多种基因的转录。Terkhorn等[12]研究发现，缺氧环境（5%）可促进HIF-3α基因表达，而HIF-3α的作用是抑制HIF-1α和HIF-2α的表达水平，使得HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α、HIF-1处于稳定的高表达反馈调节平衡。综上研究，低氧浓度有利于软骨细胞分化、增强细胞活性已达成共识，且在该环境中，细胞的湿重和软骨生成基因表达均显著增加。但影响MSCs转化为软骨细胞及增殖的相关因素复杂，在生物反应器中促软骨形成的最适氧浓度仍需进一步研究。

1.2静水压

有学者认为，软骨承受着由人体日常活动产生的间歇性静水压，如在软骨细胞培养中引入静水压及其他一些机械载量，可能会增加体外组织工程软骨的基质合成[13]。关节软骨承受的相关机械载量中，静水压是最重要的载量[14]。Ogawa等[15]通过对软骨在静水压0～0.5MPa、0.5Hz和标准大气压环境下的组织学、免疫组织学、基因表达特性进行比较，发现静水压组聚集细胞基质的速度更快，细胞衰老变缓，而且在培养2周后软骨特有基因表达明显增强。因此，他们认为静水压既可增强细胞基质积累，又可刺激软骨特有基因表达。但该实验未进一步研究最适静水压。有研究提出，7～10MPa的间歇性静水压是组织工程软骨体外培养的理想静水压[13，16]。同时，静水压越大，氧分压越大，严格控制静水压即可影响氧分压，进而改变氧浓度[13]，间接影响软骨细胞的分化及增殖。但较高压力会降低培养液中CO2浓度，也会影响细胞生长。Jeong等[17]设计了一种电脑控制式反应器测定间歇性静水压对BMSCs向软骨细胞分化的影响，实验分为5组：0.2MPa组、0.1MPa组、0.05MPa组、0.02MPa组、空白对照组，结果发现0.1MPa静水压作用明显，0.2MPa其次。目前，理想的静水压数值尚未达成一致，综合前述研究，以0.1MPa间歇性静水压对BMSCs向软骨细胞分化的作用效果最为理想。

1.3压缩力

Takahashi等[18]研究发现，静态压缩力可以促进软骨生成和分化。学者们进一步研究发现，动态压缩力促进软骨生成效果较静态压缩力更显著[19-21]；而且在BMSCs培养中，动态压缩力使得软骨分化标记物表达更多[22-24]。这与关节软骨日常功能一致，因关节软骨日常活动时产生的即是动态压缩力。Huang等[25]研究表明，兔BMSCs-琼脂糖复合体形变压缩（4h/d、10%压缩强度、1Hz）后，在存在与不存在TGF-β1的条件下Ⅱ型胶原及蛋白聚糖基因表达均明显增强，此外TGF-β1受体在压缩1h后明显上调，也进一步促进了TGF-β1的软骨化诱导作用。Richardson等[26]研究发现，在3h/d、10%压缩强度、1Hz的压缩条件下，培养第5天可见到BMSCs复合体中氨基聚糖含量增加。而类似研究也发现，4h/d加载后的氨基聚糖含量显著高于2h/d的加载方式[24-25]。表明蛋白聚糖基因的表达随着载荷时间增加而增强[23]。Hoenig等[27]评估了不同动态压缩强度（5%、10%、20%压缩强度，3000r/d，1Hz）对种植了原代猪软骨细胞的脱细胞支架的短期影响，结果显示20%压缩强度对软骨机械性能的影响最强，提示接受更高负荷强度预处理的组织工程软骨更坚硬、更符合临床要求。但该研究结果缺少更大压缩强度实验结果，尚不能说明20%压缩强度以上（如30%、40%等）情况下得到的软骨是否仍满足临床要求或性能下降，均需进一步研究。孙明林等[28]进一步研究了10%～30%压缩强度下获得的组织工程软骨性能，发现在0.4Hz、20%压缩强度、3h滚压时间的滚压参数下，BMSCs能更好地向软骨细胞分化以及维持软骨细胞表型。Huang等[29]研究认为，在生物反应器中持续应用动态压缩力将改善BMSCs来源的软骨结构机械性能。Thorpe等[30]观察了TGF培养条件下，动态压缩力对BMSCs软骨生成的影响，发现培养42d后样本中蛋白聚糖、黏多糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达比单纯动态压缩力培养下更高。

1.4剪切负荷

不同类型生物反应器中，剪切力大小各不相同。如搅拌式反应器系统和直接灌流式反应器系统中为高剪切力，旋转壁式反应器系统中为低剪切力[13]。由于剪切力对软骨内环境稳态有显著影响，了解剪切力类型至关重要。如高剪切力用于软骨细胞培养会产生骨性关节炎特性表达，即可诱导产生环氧化酶2、前列腺素和IL-6[31-32]。还有研究发现高剪切力可诱导炎性介质释放，使得软骨细胞基质分泌减少，导致软骨细胞凋亡[33]。谢甲琦等[34]研究了剪切力对MSCs的作用，发现适度的剪切力（3dyn/cm2）可以促进MSCs生长，过低的剪切力（1dyn/cm2）对MSCs生长无明显影响，过高的剪切力（>8dyn/cm2）则抑制MSCs生长并加速细胞死亡。同时，他们首次提出了对MSCs进行增加剪切力训练的概念，即渐进性增加的剪切力比恒定高剪切力更容易被细胞耐受，使细胞活力增强、存活比例增加、促进细胞增殖和转化。该研究也为生物反应器中剪应力的标准化提供了重要依据。对于软骨组织工程生物反应器系统中的剪切力最适值目前尚无统一标准，可选择初始值为3dyn/cm2，渐进性增加至8dyn/cm2，以增强软骨细胞对较高剪切力的适应能力和细胞活性，有利于细胞增殖，但尚需进一步研究明确。

2展望

综上述，在软骨组织工程生物反应器系统中，其生物物理因素的最适参数可能不是固定值，而是一个随着种子细胞转化、增殖而动态变化的渐变性参数。随着组织工程研究的深入、自动化计算机技术以及材料技术的提高，可实现对生物反应器生物物理因素的精确动态控制，建立即时控制反馈系统，选择最优调控方案。未来生物反应器发展的方向必须遵循工程化原则，规范质量监控、自动化、标准化和生产过程及组织工程器官的安全性[35]，实现其临床转化应用。

作者：叶钢章方彪史宏灿单位：扬州大学医学院胸外科