超滤质谱技术筛选板蓝根中抗流感病毒的活性成分

[摘要] 目的：筛选板蓝根中抗流感病毒的活性成分。方法：采用超滤质谱技术，筛选板蓝根中具有抗流感病毒的活性成分，并以体外神经氨酸酶活性实验进行验证。结果：通过超滤质谱筛选并鉴定出与神经氨酸酶结合的成分主要是精氨酸、告依春和腺苷，其结合常数分别为（36.23±1.12）%，（32.54±1.02）%，（9.38±0.47）%；该结果与体外酶活性实验结果一致。精氨酸、告依春的IC50分别为（1.16±0.02），（1.20±0.02） g·L-1，腺苷的IC50大于500 g·L-1。结论：精氨酸和告依春可能是板蓝根抗流感病毒的活性成分，为板蓝根质量评价指标的选择提供了科学依据；亦为中药药效物质的发现提供了一种适宜技术。

[关键词] 超滤质谱；板蓝根；活性成分；神经氨酸酶抑制活性

[收稿日期] 2013-11-17

[基金项目] 国家自然科学基金项目 （81274078， 81322052， 81303222）

[通信作者] *鄢丹，Tel/Fax：（010）66933325，E-mail： ；*肖小河，E-mail：

板蓝根Isatidis Radix为临床常用中药，主要用于治疗上呼吸道感染等疾病，疗效确切，一般认为与其抗流感病毒药理活性相关[1-4]。由于板蓝根化学成分复杂，药效物质尚不明确，影响了其质量评控水平的提升及临床疗效的稳定发挥。现行药效物质筛选模式（植化分离、药理活性示踪、血清药物化学筛选等）在推动中药药效物质发现的同时，操作繁琐、活性成分易丢失等局限也日益显现[5-7]。因此，有必要探索高通量、灵敏的中药药效物质发现新技术。

超滤质谱技术是将超滤装置与质谱技术结合后形成的一种新方法，主要是利用亲和原理，将含有潜在活性的小分子物质与受体（靶部位如蛋白或酶等）混合，形成受体-配体复合物（采用超滤薄膜除去可能含有的未结合小分子），以有机溶剂处理并释放小分子配体，进一步采用液相-质谱联用技术对其进行鉴定，从而实现活性成分的快速初筛[8]。目前，该技术在先导化合物的发现、配体与受体结合强度以及相关机制等研究方面有较广泛的应用[9-14]。

神经氨酸酶作为抗流感病毒药物的主要作用靶点之一，可协助成熟流感病毒脱离宿主细胞感染新的细胞[15]。板蓝根具有神经氨酸酶抑制活性[16-17]，本研究借助超滤质谱技术筛选板蓝根与神经氨酸酶结合的潜在活性成分，同时配以神经氨酸酶体外活性评价，以期发现板蓝根抗流感病毒可能的药效成分，将为板蓝根质量标准的提升以及中药药效物质的发现提供技术参考。

1 材料

Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters Xevo G2 Qtof质谱仪（美国Waters公司）；自动酶标仪（美国bio-tek公司）；超速离心机（德国Eppendorf 公司）；板蓝根购自安徽，经中国人民第302医院中药研究所肖小河研究员鉴定为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort. 的干燥根；精氨酸（arginine），告依春（goitrin），腺苷（adenosinea）对照品购自中国食品药品检定研究院；2-（N-吗啡啉）-乙磺酸（MES）购自sigma公司，神经氨酸酶（neuraminidase， NA）（human H1N1）购自Sino biological公司；YM-100 超滤膜购自Millipore 公司；神经氨酸酶荧光底物2′-（4-methylumbelliferyl）-D-N-acetylneuraminic acid （MUNANA），奥斯他韦酸（Oseltamivir acid）购自Toronto Research Chemicals Lnc.；甘氨酸购自北京索莱宝科技公司。甲醇和乙酸均为色谱纯（美国Fisher公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 样品制备

2.1.1 供试品溶液制备 取板蓝根药材粉末（过3号筛）约5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加水50 mL，称定质量，加热回流1 h，放至室温，加水补足质量，滤过；取续滤液25 mL，浓缩至15 mL，放冷，加乙醇20 mL，静置使沉淀，离心，过滤；另取60%乙醇10 mL洗涤沉淀过滤器，合并上清液及滤液，浓缩至近干，加水溶解定容于5 mL量瓶中，过0.22 μm微孔滤膜，样品用于超滤实验和体外酶活性实验分析。

2.1.2 对照品溶液制备 告依春对照品用甲醇配成质量浓度为2 g·L-1的储备液；精氨酸对照品用甲醇配成质量浓度为10 g·L-1的储备液；腺苷对照品用甲醇配成质量浓度为10 g·L-1的储备液。

2.1.3 参照物溶液制备 取奥司他韦酸适量，精密称定，加水制成每1 mL含50 ng的溶液，按等比级数1∶0.5稀释成4个不同浓度的参照物溶液。

2.1.4 缓冲液制备 称取MES 0.64 g， CaCl2 0.044 g溶于100 mL 超纯水中，配成浓度为32.5 mmol·L-1 MES，4 mmol·L-1CaCl2的缓冲溶液，并用氢氧化钠调节pH至6.5。

2.1.5 终止液制备 取甘氨酸1.5 g，加25%乙醇溶解，氢氧化钠试液调pH至10.7，即得。

2.2 色谱与质谱条件

2.2.1 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm， 1.7 μm），柱温25 ℃，流速0.4 mL·min-1。流动相水（A）-甲醇（B）二元梯度洗脱，具体梯度为0～3 min，95%～50% A；3～10 min，50%～30% A；10～15 min，30%～0% A；15～18 min，0%～0% A；18～21 min，95%～95% A。

2.2.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），采用正离子扫描检测；脱溶剂气流量800 L·h-1，脱溶剂温度350 ℃，锥孔气流量50 L·h-1，离子源温度120 ℃，毛细管电压正离子扫描3 200 V，负离子扫描2 700 V，锥孔电压35 V，微通道板电压3 500 V，碰撞能6 V，碰撞气氩气，碰撞室压力小于0.28 Pa。质谱扫描范围50～1 200。

2.3 超滤实验

分别吸取一定量板蓝根提取物溶液和神经氨酸酶溶液加至pH 6.5的缓冲溶液中，随后置37 ℃水浴中反应30 min后，吸取一定量转移至截留相对分子质量为100的YM-100 型超滤管中，8 500 r·min-1离心5 min，滤膜加缓冲溶液（pH 6.5）离心清洗3次，洗去未结合成分。再向滤膜中加入适量的50%甲醇，8 500 r·min-1离心7 min 释放结合配体，重复3次，收集洗脱液，冷冻干燥后加50%甲醇500 μL溶解，用于LC-MS分析。为了排除由于超滤膜对小分子的吸附作用而产生的假阳性结果，每次实验前均进行空白实验，即同法处理不加NA的药材溶液[17]。

2.4 神经氨酸酶活性实验

采用课题组已建立的神经氨酸酶（NA）活性检测法[16，18]表征药物抗流感病毒的作用强度。反应在96孔板荧光酶标板中进行，首先加入稀释的神经氨酸酶25 μL和供试品溶液25 μL，室温下作用30 min后加底物MUNANA 50 μL 37 ℃孵育60 min后加入终止液MES（0.1 mol·L-1甘氨酸，以25%乙醇配制，10%氢氧化钠溶液调pH 10.7）200 μL终止反应。测定荧光强度值，设置激发波长355 nm，发射波长460 nm，检测温度37 ℃。为便于活性比较，同时设样品测试组（NA + 样品 + MUNANA），背景对照组（样品+ MUNANA，缓冲液补足至相同体积），空白荧光组（MUNANA，用缓冲液和样品溶剂补充至相同体积），酶活性对照组（NA + MUNANA，反应终止后再加入同体积样品溶液），每组设6个复孔。

3 结果

3.1 超滤质谱筛选抑制神经氨酸酶活性成分

采用超滤质谱技术，通过比较对照组（超滤不加酶）、对照品组、药材原液组（不超滤不加酶）和实验组（超滤加酶）中成分的差异，并结合基峰总离子流色谱图（图1）和提取离子流色谱图（图2）筛选与神经氨酸酶有相互作用的成分，结果共筛选鉴定出3个可与NA结合的化合物，分别为精氨酸、告依春和腺苷。在本实验条件下，实验组（超滤加酶）色谱图主要集中在4 min内。

由图2可知，板蓝根药材提取离子流图中精氨酸、告依春、腺苷的保留时间分别为0.344，0.455，0.491 min。Q-TOF-MS给出的准分子离子峰分别为精氨酸m/z 175.119 0，告依春m/z 130.033 2，腺苷m/z 268.104 6，分别与对照品精氨酸、告依春、腺苷比对，具有相同的保留时间、准分子离子峰，由此可以确认上述3种化合物分别为精氨酸、告依春、腺

A. 对照组（未加酶组）；B. 对照品组；C. 板蓝根药液组；D. 实验组（加酶组）。

图1 不同组别样品总离子流图

Fig.1 The total ion chromatogram of different groups

苷。对照组和实验组中化合物亦按照上述方法进行确认。

由于色谱峰的积分面积与其相应的浓度成正比，故可以通过超滤前后色谱峰积分面积的变化程度来反映相应化合物与生物靶分子的结合程度。按如下公式进行计算[20]：结合率=（Ae-Ac）/A×100%，其中A为药物原液色谱峰的积分面积，Ae为实验组色谱峰的积分面积，Ac为对照组色谱峰的积分面积。

利用这种计算方法对板蓝根药材中各组分与靶分子的相对结合强度进行计算，3次独立重复实验结果显示精氨酸、告依春、腺苷的结合常数分别为（36.23±1.12）%，（32.54±1.02）%，（9.38±0.47）%（精氨酸>告依春>腺苷）。比较结合常数可以看出，精氨酸和告依春与神经氨酸酶的结合强度较大，提示精氨酸和告依春可能是板蓝根抑制神经氨酸酶的活性成分。

a. 对照组（未加酶）； b. 板蓝根药液组； c. 实验组（加酶组）；1.精氨酸；2.告依春；3.腺苷。

图2 不同成分提取离子色谱图

Fig.2 The extracted ion chromatogram of different compound

3.2 体外神经氨酸酶抑制活性验证实验

采用体外神经氨酸酶活性实验进一步验证超滤质谱初筛实验结果（以NA为阳性药），结果表明，精氨酸、告依春和腺苷超滤质谱的结合常数与体外神经氨酸酶活性检测结果吻合度良好，提示超滤质谱技术在初筛中药活性成分具有高通量、灵敏、准确等优势（图3）。

4 讨论与结论

本研究借助超滤质谱技术，通过比对不同组别板蓝根样品超滤前后成分的变化情况，筛选并鉴定出精氨酸、告依春与神经氨酸酶结合能力显著；进一步以体外神经氨酸酶活性实验验证，发现精氨酸和告依春可能是板蓝根抗流感病毒的活性成分，为板蓝根质量评价指标的选择提供了科学依据，有助于

*腺苷IC50大于500 g·L-1。

图3 初筛成分超滤质谱结合常数与体外活性IC50对比图（n=3）

Fig.3 Comparison of binding degree and IC50of the screening compounds against neuraminidase（n=3）

其质量标准的提升。

与药效成分常规筛选方法相比，超滤质谱技术是基于对药物小分子与其活性发挥关键靶点（蛋白、酶等）相互作用的共识而建立的中药活性成分初筛技术，具有高通量、灵敏、快速等技术优势，适合用于活性成分的早期筛选、活性强度评测以及相关机制初步探索研究。同时，结合中药多成分、多靶点作用特点，深入开展不同关键靶点和体内试验以确认初筛的活性成分将是十分重要而有意义的研究工作。

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Screening bioactive compounds inhibiting influenza virus from Isatidis

Radix by ultrafiltration mass spectrometry

MA Li-na ZHANG Cong-en， YAN Dan， TAN Man-rong， LI Han-bing， ZHANG Le-le， XIONG Yin， XIAO Xiao-he

（1.College of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610075， China；

2. China Military Institute of Chinese Materia Medica， 302 Military Hospital， Beijing 100039， China；

3.College of Pharmacy， He′nan University of Traditional Chinese Medicine， Zhengzhou 450008， China）

[Abstract] In vitro neuraminidase inhibition assays and ultrafiltration liquid chromatography with diodearray detector coupled to time of flight mass spectrometer （UPLC-DAD-TOF-MS） were combined to screen bioactive compounds inhibiting neuraminidase from Isatidis Radix. By comparing the compounds from Isatidis Radix before and after ultrafiltration， we found that arginine， goitrin and adenosinea can bind with neuraminidase， and the binding degree of the three compounds were （36.23±1.12）%， （32.54±1.02）% and （9.38±0.47）%， respectively. The IC50of arginine and goitrin were （1.16±0.02）， （1.20±0.02） g·L-1， respectively. While the IC50of adenosinea was higher than 500 g·L-1. The results showed that arginine and goitrin might be the main compounds with antiviral activity of Isatidis Radix. This study may provide a useful method for the screening of bioactive compounds and quality control of Isatidis Radix.

[Key words] ultrafiltration mass spectrometry； Isatidis Radix； active compounds； inhibiting neuraminidase activity

doi：10.4268/cjcmm20140511