PCR技术应用于动物医学论文

1、AP－PCR的基本原理

AP－PCR基本原理与常规PCR类似，均为引物指导下的DNA扩增，同样包括变性、退火、延伸的基本步骤，其不同之处在于普通PCR使用的是序列特异性引物而AP－PCR过程中的引物是10个左右非特异性寡聚核苷酸链（随机引物）。AP－PCR之所以能进行是因为在反应过程中引物和模板并不需要完全的匹配，在较低的退火温度下，只要引物的一部分特别是3′端有3～4个以上碱基与模板（DNA或RNA反转录的cDNA）互补复性且方向正确，距离在一定长度范围内，在TaqDNA聚合酶的作用下就可扩增出一定长度的DN段，利用多个随机引物可使检测区域扩大至整个基因组（Babu等，2014）。扩增后的产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，核酸染料或放射性自显影得到DNA指纹图谱，从而分析比较其多态性或进一步克隆分析（Babu等，2014）。

2、AP－PCR的技术方法和优缺点

2．1模板DNA提取和质量检测

模板DNA提取的方法有很多，应根据组织的不同和试验需要确定，但其基本的原理相同，都是通过酶或有机试剂裂解组织使核酸游离出来，然后通过有机溶剂或吸附柱纯化后提取。核酸的浓度和质量可通过UV分光光度计读取D260nm与D280nm的比值和1％琼脂糖凝胶电泳等检测来确定（Mohini等，2011）。目前已有很多商品化的核酸提取试剂盒可供选择，使用方便并可得到较高质量的模板（DNA或cDNA）。

2．2随机引物的选择

随机引物长度通常为10个碱基，GC的含量为60％～80％的寡聚核苷酸链，随机引物不仅核苷酸的排列顺序是随机的，而且所有引物的序列无直接相关性（韦莉萍，2001）。理论上，如果1条随机引物反应可产生x个独立的条带，那么a条随机引物同时参与反应就可得到xa2个条带，但多条引物同时参与反应会相应的增加结果的复杂性和不稳定性（Nandani等，2014）。随机引物虽然可用于所有物种，但并不是所有的随机引物扩增出来的结果都有意义，想要得到较为理想的结果仍需根据研究对象和研究目的进行引物的筛选和反应条件的优化，一般来说选择能产生中等复杂度的图谱的引物（Nandani等，2014）。

2．3AP－PCR扩增条件

AP－PCR也包括变性、退火、延伸的经典PCR过程。变性过程在94℃进行，一般来说预变性3～5min；退火温度在35～38℃，也可根据引物Tm值来确定，一般退火温度比引物Tm值低3～5℃；延伸温度在72℃，在此温度下Taq酶的合成效率约为2000bp／min（Kumari等，2013）。AP－PCR的试验条件、模板的质量和浓度及反应体系中Mg2＋的浓度等都可能对扩增的结果产生影响，想要得到较为理想的试验结果，反应体系的优化和试验操作的标准化是非常重要的（Mohini等，2011；Kumari等，2013；Babu等，2014）。

2．4AP－PCR的优点

AP－PCR延续了PCR的效率高、灵敏度高、样品用量少等优点，同时又兼有自身的优点：①不同种类的生物样品即可使用通用的随机引物进行基因分析（Welsh等，1991）；②可在对研究对象不了解的情况下进行基因多态性分析，从而对研究对象进行遗传分析和分类研究（Williams等，1990；Welsh等，1991）；③对于研究对象DNA样品量有限的情况也适用（Nandani等，2014）；④随机引物易获得，试验成本低，技术容易掌握，除此之外，可对AP－PCR产生的基因条带进行纯化和克隆，以便进一步分析（Ge等，2014）。

2．5AP－PCR的局限性

AP－PCR虽然具有很多独特的优势，但目前仍处于应用的探索阶段，其本身仍有局限性：①AP－PCR技术通常是对显性基因标记进行分析，这就意味着不能将纯合子与杂合子区别开（Babu等，2014）；②由于无明确的目的序列，如果发生扩增条带的缺失就无法得知是什么原因导致的，不利于对扩增结果的分析（Kumari等，2013）；③AP－PCR的结果分析需要专业的带谱分析知识，否则很难从结果中得到有意义的信息；④AP－PCR结果的重复性问题一直是限制其广泛应用的主要原因，由于其结果受DNA模板的质量、反应体系成分和反应条件的变化等因素的影响，其扩增产物的稳定性难以控制（Mohini等，2011）；⑤AP－PCR结果通过凝胶电泳来观察，但迁移率相同的谱带的核苷酸同源型不明等情形易造成干扰，有时电泳迁移率相同的片段并非同源，这就给结果分析带来很多不确定性（Nandani等，2014）。

3、AP－PCR技术研究进展

3．1AP－PCR技术自身的优化

近年来，不断有研究者对AP－PCR技术进行改进和优化，使其更具可操作性、实用性和更广泛的应用领域。刘刚等（2004）对AP－PCR进行了优化，建立了多重随机引物PCR（M－RAPD）技术，M－RAPD通过使用3条组合的随机引物在较高的退火温度下对肺炎链球菌、粪肠球菌和大肠埃希菌耐药菌株等的染色体DNA进行扩增获得了稳定的种株特异性的DNA指纹图，其所提供的基因信息要远多于传统的RAPD技术。Xiong等（2012）对AP－PCR进行了反应程序优化和随机引物中G／（G＋C）不同比例研究，结果表明，反应程序中从退火步骤到延伸步骤的时间延长，温度变化由3℃／s下降到0．3℃／s时，PCR产物条带明显增加，这可能是由于延长温度变化的时间可提高引物与模板结合的稳定性（Fu等，2000），在比较了随机引物中G／（G＋C）不同比例的PCR产物后发现，当G／（G＋C）比例在0．7时PCR产物的条带最多，也更适用于进行AP－PCR反应，因此反应程序的温度变化和随机引物中G／（G＋C）的比例可能也是影响AP－PCR结果的重要因素。Zou等（2003）报道了利用两步AP－PCR方法在微量DNA样品中扩增未知序列DNA并进行克隆。第1步PCR利用29个核苷酸序列的引物进行扩增，Ran5－29（5′－GTTCTACACGAGTCACTGCA－GNNNNNNNTGGC－3′），这一随机引物包括21个已知核苷酸序列部分，7个随机核苷酸序列和1个3′端TGGC的卡子结构，在随机序列前6个核苷酸序列构成了1个PstⅠ位点，其中3′端卡子结构在退火时可与含有GCCA位点结合，保证了随机序列可与GCCA上游的序列匹配，3′端TGGC的卡子结构可使引物与模板的匹配数增加7～11个核苷酸，PstⅠ位点决定PCR产物的长度，并保留1个黏性末端，保证了克隆的顺利进行。第2步PCR使用可与Ran5－29相匹配的19个核苷酸的Fix5－29（5′－GTTCTACACGAGTCACTGC－3′）作为引物，获得的产物进行纯化、克隆分析。结果表明这种策略可检测临床样本DNA的最小量在1pg，克隆灵敏度达到100fg目的DNA模板。这种方法较普通AP－PCR灵敏度更高，适用于样本量极少的临床样品检测。Clem等（2007）在对比了AP－PCR方法的不同扩增策略，在此基础上建立一种快速有效的检测不明病原的多重随机RT－PCR方法。在对血液样本进行过滤后加入了DNase和RNase消化，利用宿主基因对DNase和RNase敏感而衣壳保护的病毒对其不敏感的特点，去除宿主自身基因的污染。其利用单一十聚核苷酸为引物，引物序列为（V8A2）5′－VVVVVVVVAA－3′，V＝A、G或C，3′2个A提供了一个“lock”结构，引物中不含有胸腺嘧啶脱氧核苷酸（T）可避免发生引物二聚体，但这一结构不可避免的会影响引物与模板的结合。试验结果一旦监测到病毒的扩增产物即可通过鸟枪法克隆测序鉴定。这一方法对病毒的出现或重组进行快速监测和鉴定有很强的实用性，其检测灵敏度达到1000克隆／mL，应用这一技术成功从血液样品中检测并获得了3种独立病毒的部分序列。

3．2以AP－PCR为基础衍生的分子生物学技术

随着分子生物学技术的发展，单一的AP－PCR技术已不能满足研究的需要，因此为了克服AP－PCR的一些缺点在其基础上衍生出包括非序列依赖单引物PCR（SISPA）、简并核苷酸引物PCR（DOP－PCR）、DNA扩增指纹印记（DAF）、微卫星引物PCR（MP－PCR）等分子生物学技术。SISPA方法最早是由Reyes等（1991）建立起来的，其以AP－PCR为基础，非对称的单一引物与DNA模板的钝末端直接连接，随后经过若干循环的变性、退火和延伸后，模板的数量得到扩增，后经克隆、测序、分析得到基因序列。Breitbart等（2005）在SISPA的基础上建立了DNase－SISPA联用的方法，增加了样品过滤和DNA酶消化等步骤，成功的从人的血液临床样品中发现了新的病毒基因。Djikeng等（2008）在已有研究基础上进行了新的改进，在样品的处理中加入RNase酶以清除外源RNA的污染如核糖体RNAs。针对有polyA尾的病毒，在反转录过程中加入六聚核苷酸随机引物5′端加入一段病毒特异性引物序列，形成结合引物（FR26RV－N：5′－GCCGGAGCTCTGCAGATATC－NNNNNN－3′），同时加入连接polyT的引物（FR40RV－T：5′－GCCGGAGCTCTGCAGATATC－TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT－3′）以增加对病毒基因3′端的覆盖率。这种在六聚体随机引物连接一保守序列即病毒特异性引物，可增加对病毒基因5′的捕获，从而使SISPA的成功率大大提高。DOP－PCR技术是在AP－PCR基础上建立起来，其引物（DOP－ORI－Xho）由22个核苷酸组成，3′和5′端的特异核苷酸序列和中间的6个核苷酸构成的随机引物组成（Telenius等，1992）。由于随机引物的简并性，每个反应包含着数以千对的引物。DOP－PCR的反应程序包含2个不同的部分，前5个循环引物的3′端至少有12个连续的核苷酸与模板DNA相结合，对引物和模板的匹配度要求不高，在随后的30～40个循环里，扩增错配的几率会逐渐降低。初始反应产物将成为模板，用相同的引物进行扩增，扩增产物通过克隆测序即可获得基因序列（韩焘等，2013）。Csaba等（2002）打破了DOP－PCR只用同一种引物的传统，尝试了5条新的可用于反应的引物，使反应时间由原来的7～8h缩短为2h，缩短了变性过程的时间，在取得理想结果的同时，减少了扩增酶的用量，提高了DOP－PCR的效率和实用性。DAF是一种改进的AP－PCR分析技术，与AP－PCR技术不同的是，DAF使用的引物浓度更高，长度更短（约5～8个碱基），在PCR反应上只包含2个温度的循环，省去了延伸的步骤，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过银染方法观察结果。DAF通常会产生非常复杂的带型，因此它所提供的谱带信息也比AP－PCR大得多（Caetano－Anolles等，1993）。Al－hag等（2007）应用DAF鉴定8株细胞系，研究结果表明，DAF可产生稳定的可供区分的PCR谱带。Ehsan等（2011）应用DAF技术对分离到的25株牛隐孢子虫进行亚型的鉴定，结果发现分离的25个虫株分属于为3个不同的亚型。MP－PCR是以AP－PCR为基础的分子标记技术。Ma等（1996）发现真核生物基因组中存在短串联重复序列，又称微卫星DNA或简单重复序列（simplesequencerepeats，SSR）。真核生物基因组中SSR的分布是随机的，大约每隔10～50kb就有1个SSR。SSR位点最常见是双核苷酸重复，即（CA）n和（TG）n，每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10～60个。MP－PCR的引物是与SSR位点互补的二聚或三聚核苷酸重复序列，如其引物序列可是（TA）10或（CGA）6，扩增的是SSR之间不同长度的DNA序列，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率（Dawson等，2013）。MP－PCR克服了AP－PCR引物的不确定性，增加了PCR产物谱带的稳定性和针对性，该技术也已广泛应用于物种分子标记、基因图谱绘制和基因差异性分析等方面（Tian等，2014；Ding等，2014；Wei等，2014）。

3．3AP－PCR与其他分子生物学技术的联用

扩增片段长度多态性（AFLP）技术是将基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DN段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点（Rikalainen，2013）。针对AP－PCR结果谱带核苷酸同源性无法确定的缺点，Tan等（2011）将AP－PCR与AFLP进行联用，利用2种方法各自的优势，在对可能含有未知病原的临床样品进行检测，以实验室确诊的登革1型病毒为阳性对照，首先用AP－PCR对有限的样品基因进行随机扩增，然后使用AFLP技术对进行扩增从而得到样品稳定的DNA多态性标记。此方法克服了AP－PCR的同源性不明问题，同时比单独使用的AFLP方法进行检测的灵敏度提高100倍，在临床样品的检测中有很大的实用价值。高通量的测序技术也被称为下一代的测序技术，其与AP－PCR技术的配合使用，让AP－PCR有了更广阔的应用前景。Hang等（2012）首先使用锚定随机引物P17N8（5′－GTTTCCCAGTAGGTCT－CNNNNNNNN－3′）进行RNA反转录，在通过锚定随机引物P17N8和P21（5′－CGCCGTTTCCCAG－TAGGTCTC－3′）同时进行AP－PCR扩增，再通过高通量的测序技术对PCR产物进行测序，对得到的基因序列进行拼接处理，从而得到了奥罗普切病毒和卡拉帕鲁病毒L片段完整基因序列。vanderHeij－den等（2012）利用序列非依赖性病毒基因片段扩增方法与Roche－454测序技术联用，成功的从患急性肝炎病犬的肝脏组织检测出犬Ⅰ型腺病毒基因，研究结果表明AP－PCR技术和下一代的测序技术联合使用的方法在获得病毒完整基因序列和检测病原等方面的实用性。

4、AP－PCR技术在动物医学中的应用

4．1在传染病流行病学和病原遗传学分类中的应用AP－PCR由于其独特的技术优势，在兽医传染病学和病原遗传学分类中已得到广泛应用。Leh－marn等（1992）用此技术对念珠菌属的分离菌进行分析，试验结果表明，同一菌种的不同菌型间呈现出DNA长度的多态性；此带型图在同一菌种的不同菌型间，其相似程度远大于不同种的菌株，这也说明每种菌的随机引物PCR带型极具特征性。Louie等（1996）用2种引物检查15株李斯特单核菌相关流行分离株和36株不相关流行分离株。经扩增后的带型分析，将其分为9个型，每个型中又分有不同的亚型。Zadoks等（2000）在牛乳样品中分离到23株金黄色葡萄球菌，经AP－PCR鉴定1～8株属于Ⅰ型菌，9～20株属于Ⅱ型菌，其余3株分别属于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型菌。Butler等（2001）应用该技术对3次牛霉形体暴发流行菌株进行了检测，结果表明，发生在其中2个养牛场的流行病原菌具有一致的指纹图，引而具有相同的感染来源，而在另一牛场分离的菌株间则显示了指纹图谱的显著异型性，说明它们具有多个感染来源。王雪敏等（2011）利用多组随机引物对副鸡禽杆菌10个国际标准株、血清C型疫苗株和4个国内分离株进行AP－PCR扩增，结果显示，所有菌株可分为11个谱型，聚为4类。划分的11个谱型可和现有分型方法中的不同亚型一一对应，提示这种方法可区分不同血清亚型。AP－PCR作为寄生虫遗传学分类鉴定的方法已得到广泛应用，克服了传统分类方法难以解决的问题。Macph－eson等（1993）应用AP－PCR技术区分来自不同宿主的7种艾美尔球虫，结果表明选择合适的引物可对7种球虫进行鉴别。张伟信等（2003）应用该技术对鸡柔嫩艾美耳球虫不同地理株的多态性研究，结果表明不同地理株间及同一地理株亲代与子代间均存在DNA多态性差异，其中不同地理株间种内变异程度较大，同一地理株子代与亲代间也发生遗传变异，但变异程度较小。

4．2在病原差异基因分析中的应用

AP－PCR技术进行RNA指纹图谱分析不仅能鉴定基因的表达差异，而且能显示低水平表达的基因差异。Nicho－las（2000）应用此方法鉴定了丝裂霉素C诱导下鼠伤寒沙门氏菌SOS调控基因表达的差异，结果表明，丝裂霉素C诱导后21条基因谱带出现表达水平的上调，其中20个基因片段对应的是可辨识的基因序列，15个基因序列与数据库中基因序列无同源性，被确定为新的表达序列，6个基因片段与SOS基因编码的调控蛋白有关。Diana等（2005）应用AP－PCR技术对苄硝唑作用下克氏锥虫基因表达差异多态性的研究，结果发现对苄硝唑敏感和对苄硝唑抵抗种群之间系统指纹图谱存在一定的差异，其中可能存在克氏锥虫对苄硝唑拥有抗性的表达机制，虽然抗性种群在苄硝唑作用下系统指纹图谱没有明显的变化，但敏感种群间的系统指纹图谱却有着明显的变化。AP－PCR技术为鉴定基因差异提供了一种快速有效的方法。

4．3在未知病原检测中的应用

病原微生物引起的动物疫病呈现出复杂性和非典型性等特征，普通的临床诊断方法很难确定病原的种类，这种情况下使用传统PCR方法检测临床样品的效率不高，而且存在漏检可能。AP－PCR技术提供了一个更为全面、快速和灵活的检测方法，对病原微生物进行全基因组的检测（姚四新等，2010）。Djikeng等（2008）使用DNase－SISPA技术在牛的血清中分离到牛鼻病毒基因。Clem等（2007）利用改进的AP－PCR方法，从血液样品中检测并获得了3种独立病毒的部分序列，即腺病毒17、卡萨奇病毒A7和呼吸道合包体病毒B。周斌等（2004）在研究鸭病毒性肝炎病毒时，发现其种毒可能受到污染，随后挑选4条随机引物对其进行反转录PCR扩增，共扩增出3条基因片段。克隆测序的结果表明，与禽腺病毒（鸡胚致死孤儿病毒）基因组部分序列同源性分别高达99．5％、99．6％和99．5％，从而确定了鸭病毒性肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒受到禽腺病毒的污染。黄欣梅等（2011）采用DNase－SISPA对导致鸭、鹅产蛋下降的病原基因进行扩增，并在此基础上设计了1对特异性引物成功的扩增出新型鹅黄病毒JS804毒株基因。

5、小结

AP－PCR技术由于其简单、高效、实用等技术优势，已广泛应用于分子生物学的各个领域。未来，AP－PCR技术的发展可能朝着2个方向行进：①通过其本身的技术进步和完善，包括各种随机引物的开发、反应成分的优化和反应程序的标准化等措施，克服试验结果过度复杂和重复性差等问题；②通过与其他技术方法的联用，如与AFLP和新一代测序技术的配合使用，利用其技术优势，避开其缺点，拓宽应用领域。目前，AP－PCR技术已经成功应用于动物医学领域的相关研究，相信随着其技术的发展，应用潜力也将得到进一步的开发，必将成为动物医学研究中的重要方法之一。

作者：沈学怀 张丹俊 潘孝成 赵瑞宏 胡小苗 戴银 侯红艳 周学利 朱传民 单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所