乳铁蛋白对原代大鼠成骨细胞IGFBP―3、IGFBP―4、IGFBP―5 mRNA表达的影响

[摘要] 目的 研究乳铁蛋白对原代大鼠成骨细胞胰岛素生长因子结合蛋白-3（IGFBP-3）、胰岛素生长因子结合蛋白-4（IGFBP-4）、胰岛素生长因子结合蛋白-5（IGFBP-5）mRNA表达的影响。 方法 用混合酶消化法分离大鼠颅骨成骨细胞，进行原代培养。细胞以6×103/cm2接种于六孔板内，用不同浓度乳铁蛋白即0 μg/ml（对照组）、0.1 μg/ml（乳铁蛋白1组）、1 μg/ml（乳铁蛋白2组）、10 μg/ml（乳铁蛋白3组）、100 μg/ml（乳铁蛋白4组）、1000 μg/ml（乳铁蛋白5组）干预原代大鼠成骨细胞1、3、5、7 d后提取总RNA，采用荧光定量PCR技术分析IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表达。 结果 与对照组比较，各浓度组及时间段对IGFBP-3 mRNA表达的影响不稳定，时高时低。与对照组比较，除了乳铁蛋白1组外，其他浓度对IGFBP-4 mRNA的表达呈浓度梯度的抑制（P

[关键词] 乳铁蛋白；成骨细胞；胰岛素生长因子结合蛋白-3；胰岛素生长因子结合蛋白-4；胰岛素生长因子结合蛋白-5

[中图分类号] R329.2+4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（b）-0004-05

乳铁蛋白是一种分子量为80 kDa的铁结合蛋白，属于转铁蛋白家族，主要存在于母乳、中性粒细胞及其次级颗粒中[1]。正常情况下，乳铁蛋白在体内的浓度为2×106～6×106 g/ml[2]，具有免疫调节、抑菌抗炎等作用，是一种多效应因子[3-4]。近年来，乳铁蛋白被发现具有促进成骨细胞增殖和骨生长的作用。除了胰岛素样生长因子结合蛋白1（insulin-like growth factor binding protein 1，IGFBP-1），成骨细胞表达IGFBP-2～6，它们是六种同源异构物[5]。大量相似的研究发现，成骨的增殖和骨形成受胰岛素生长因子结合蛋白的调控，其中IGFBP-3，4，5很可能是发挥作用的关键因子。本研究通过不同浓度乳铁蛋白作用于原代鼠成骨细胞1、3、5、7 d后用实时荧光定量PCR检测大鼠成骨细胞IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表达，以探讨乳铁蛋白影响成骨细胞增殖及与IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5之间的关系机制。

1 材料与方法

1.1 材料

出生24 h内的SD乳鼠（吴氏动物），牛源乳铁蛋白（恒天然 Fonterra，纯度>90%），胎牛血清（GIBCO），DMEM（GIBCO），0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO），双抗（青霉素、链霉素，Hyclon公司），碱性磷酸酶染色试剂盒（南京建成生物公司），SABC免疫组织化学试剂盒（武汉博士德公司），Ⅰ型胶原酶（Invitrogen）DMSO（GIBCO），TRIZOL（美国Invitrogen公司），RNAiso Plus（TAKARA），Primescript RT reagent kit（TAKARA：DRR037A），dH2O，引物（TAKARA），SYBR？ Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time）（Takara Code：DRR081），反转录仪（Takara），实时荧光定量PCR仪（Takara），紫外分光光度计（NanoDrop ND-1000）。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠成骨细胞的培养

取出生24 h内的SD乳鼠6只，颈部脱臼处死消毒，剪下头颅浸泡于75%乙醇5 min。将头颅置于装有PBS的培养皿中，剔除颅骨的结缔组织及其骨膜。用PBS冲洗骨片至发白后将其剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织片。3 ml 0.25%胰酶（含EDTA）磁粒子37℃恒温搅拌15 min，去上清后加入0.25%胰酶和Ⅰ型胶原酶（1 ml∶4 ml）混合物，再次37℃恒温搅拌消化60 min。取上清，1000 r/min离心10 min后弃上清。取10%完全培养液6 ml重悬，一分为二置于两个培养瓶中，10 min差速贴壁分离成纤维细胞两次后置于37℃、湿度5%的细胞培养箱内培养。

1.2.2 成骨细胞的鉴定

1.2.2.1 细胞形态学观察 在倒置相差显微镜下观察细胞形态结构及生长状况。

1.2.2.2 碱性磷酸酶染色 采用偶氮偶联法，将二代细胞接种于5 cm×5 cm无菌盖玻片上，置于6孔板培养。固定：取出细胞爬片用固定液固定3 min左右；加底物应用液：在固定后的细胞爬片上滴加新鲜配制的底物应用液并盖满样本部分，加盖疏水膜，放置湿盒中，避光37℃孵育15 min，水洗；复染：用苏木素或甲基绿染3 min，水洗，镜检，拍照。

1.2.2.3 Ⅰ型胶原免疫组织化学（SABC法） 取出提前制备好的密度均匀的细胞爬片，PBS洗3遍，5 min/次，用多聚甲醛固定30 min；吸出固定用的多聚甲醛，用PBS洗3遍，5 min/次，用蒸馏水洗3次，2 min/次；用3%H2O2去离子水室温孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶活性；蒸馏水浸泡冲洗5 min；滴加封闭山羊血清工作液，室温下孵育15 min，甩去多余液体勿洗；滴加稀释的一抗，即兔抗大鼠的Ⅰ型胶原抗体，浓度为1∶100，37℃孵育2～3 h或4℃过夜（对照组不加一抗，用蒸馏水代替）；PBS冲洗3 min×3次，加入生物素标记山羊抗兔二抗；20～37℃孵育20 min，用PBS洗2 min×3次；滴加试剂SABC，20～37℃孵育20 min，PBS洗5 min×4次；DAB显色：取1 ml蒸馏水，加入试剂盒中A、B、C液各1滴，混匀后加至细胞爬片，室温下显色，镜下控制反应时间（5～30 min），蒸馏水冲洗；镜下观察染色情况并拍照。

1.2.3 实验分组

实验根据乳铁蛋白浓度共分为6组，分别为对照组（0 μg/ml）、乳铁蛋白1组（0.1 μg/ml）、乳铁蛋白2组（1 μg/ml）、乳铁蛋白3组（10 μg/ml）、乳铁蛋白4组（100 μg/ml）、乳铁蛋白5组（1000 μg/ml）。

1.2.4 实时荧光定量PCR测定IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的相对表达量

1.2.4.1 引物的设计和合成 引物详细信息从GenBank获取，引物合成由TAKARA Biotechnology （Dalian）Co.，Ltd.完成。引物序列和分子量见表1。

1.2.4.2 总RNA的提取和cDNA的合成 贴壁细胞总RNA的提取按照RNAiso Plus（Takara code：D9108A）的操作说明书提取，用紫外分光光度计检测浓度和纯度，并经琼脂糖凝胶电泳鉴定完整性。参照Primescript RT reagent kit （Takara公司）说明书配制反转录反应体系，在反转录仪上进行cDNA的合成。

1.2.4.3 实时荧光定量Real Time PCR反应 根据说明书配制PCR反应液后在扩增仪上进行PCR反应。PCR扩增标准程序：Stage one：预变性（Repeat 1），95℃ 30 s。Stage two：PCR 反应（Repeat 40），95℃ 5 s；60℃ 30 s（荧光信号采集）。Stage three：融解曲线分析（Repeat 1），95℃ 15 s；60℃ 30 s；95℃，15 s荧光信号采集。

根据Real Time PCR反应结果中的Ct值，进行mRNA的相对表达量计算，每组设3个平行孔，实验分别重复3次。mRNA的相对表达量计算：设定对照组相对表达量为1，表达差异计算：=2-ΔΔCt。ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）实验组-（Ct目的基因-Ct管家基因）对照组。2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学分析软件处理数据，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用重复测量设计的方差分析，以P

2 结果

2.1 相差显微镜下的原代大鼠成骨细胞（染色前）

在相差显微镜下观察细胞，发现细胞状态良好，细胞完全伸展，折光性好，可见胞核及胞质，体积较大，胞质丰富，多为单核，有多边形、长梭型及三角形，呈“铺路石样”排列，胞质向外伸展，并伸出突触，符合成骨细胞的特征（图1）。

2.2 成骨细胞鉴定

2.2.1 SABC：Ⅰ型胶原酶免疫组织化学结果

免疫组织化学染色结果阳性，胞质被染成棕黄色，符合成骨细胞特征（图2）。

2.2.2 ALP鉴定结果

倒置相差显微镜下可见细胞呈典型成骨细胞特征，贴壁生长，体积较大，胞质丰富，形态不规则，多为单核，有1～3个核仁，细胞呈三角形、多边形、长梭形等，呈“铺路石样”排列，胞质向外伸展，并伸出突触。碱性磷酸酶染色结果显示，细胞呈阳性反应，细胞核呈蓝紫色，胞质中有咖啡色颗粒，有少量颗粒分散在细胞周围，符合成骨细胞特征（图3）。

2.3 不同浓度乳铁蛋白干预原代大鼠成骨细胞1、3、5、7 d后对IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA表达的影响

2.3.1 IGFBP-3 mRNA的表达

第1天，乳铁蛋白1～5组与对照组比较，乳铁蛋白4、5组抑制了IGFBP-3 mRNA的表达；第3天差异无统计学意义（P>0.05）；第5天，乳铁蛋白1～4组与对照组比较，抑制了IGFBP-3 mRNA的表达，而乳铁蛋白5组又促进了其表达，但是促进趋势不高；第7天，乳铁蛋白3、4组与对照组比较，抑制了IGFBP-3 mRNA的表达，而乳铁蛋白5组又促进了其表达（表2）。可见，乳铁蛋白对IGFBP-3 mRNA表达的调控不稳定，与时间和浓度不呈一定规律性。

2.3.2 IGFBP-4 mRNA的表达

第1、5天，与对照组比较，除了乳铁蛋白1组外，其他各组对IGFBP-4 mRNA的表达呈一定浓度梯度的抑制（P

2.3.3 IGFBP-5 mRNA的表达

第1天，与对照组比较，乳铁蛋白1～5组对IGFBP-5 mRNA的表达主要起抑制作用（P

3 讨论

乳铁蛋白是一种铁结合蛋白，主要存在于母乳、中性粒细胞及其次级颗粒中[1]，近年来被发现有促进成骨细胞增殖的作用[5-6]。Cornish等[7]利用培养3周的原代大鼠成骨细胞研究以评估骨小结形成，骨小结形成包括分化的成骨细胞的两种骨形成活动即骨基质沉积和矿化，研究发现乳铁蛋白剂量依赖性地增加骨小结数量及骨矿化区。同时，本课题前期研究[8]发现不同浓度乳铁蛋白干预原代大鼠成骨细胞1、3、5、7 d后具有促进成骨细胞增殖的作用。目前，乳铁蛋白作用的分子机制大部分仍未清楚。最近，有研究用芯片技术研究乳铁蛋白对成骨细胞基因表达的改变，发现上调了人原代成骨细胞胰岛素样生长因子1（IGF-1）mRNA的表达[9]，成骨细胞IGF-1表达上调后，与IGF-1受体（IGF-1R）结合，引起胰岛素受体底物1（IRS-1）磷酸化，再激活PI3K依赖的Akt，最后促进成骨细胞增殖和存活。但是，激活这条信号通路的前提是IGF-1与胰岛素生长因子结合蛋白（IGFBPs）分离，这样游离的IGF-1才能与IGF-1R结合[10]。并且生理条件下，IGFBPs比IGF-1更加严密调控着成骨细胞的增殖与骨形成[11]。故而，关于IGFBPs与成骨细胞增殖和骨形成的相关研究不断涌出。有研究指出持续过表达IGFBP-3的转基因小鼠，被发现破骨细胞数量和骨吸收明显增加，而抑制了成骨细胞的增殖和骨形成[12]。同时，有研究用rhIGF-1/IGFBP-3复合物发现有促进骨形成的作用[13]。与骨相邻的肿瘤细胞可以释放IGFBP-4，其可能抑制IGF-1促进成骨细胞增殖的作用，并且导致骨形成减少[14]。也有研究指出IGFBP-5可促进IGF-1对成骨细胞的刺激作用[11]。分别向敲除IGF-1的成骨细胞和野生型小鼠成骨细胞内添加IGFBP-5后，发现成骨细胞增殖以及骨形成标记的ALP活性和骨钙素的表达增加。同样的，分别在敲除IGF-1和野生型小鼠颅骨外骨膜上局部注射rhIGFBP-5后，骨形成系数和标志ALP以及骨钙素增加[15]。有体外研究发现，过表达IGFBP-5的小鼠成骨细胞株MC3T3却发现成骨细胞功能降低，骨形成标记和骨基质形成减少[16]。可见，IGFBPs在影响成骨细胞增殖和骨形成的作用上存在争议。但是，不可否认的是IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5在调控骨量和影响成骨细胞增殖方面可能发挥着重要作用。

故而，根据一系列研究，本研究提出乳铁蛋白是否可以通过影响IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5的表达而达到调控骨量和影响成骨细胞增殖的作用这一问题。然而要证明这点，首先得探索乳铁蛋白是否影响了IGFBPs的表达。正如本研究结果显示乳铁蛋白影响原代大鼠成骨细胞IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表达。其中，乳铁蛋白对IGFBP-3、IGFBP-5 mRNA的表达的调控不稳定，不同时间及浓度的干预对其的表达没有一定的规律性。对IGFBP-4 mRNA的表达的影响呈时间和浓度的依赖性，浓度越高抑制作用越强，故而进一步猜测乳铁蛋白影响胰岛素生长因子结合蛋白的表达可能在乳铁蛋白调控骨量和影响成骨细胞增殖方面可能发挥着重要作用。但是，IGFBP-3、-4、-5在蛋白水平是否受到影响未可知。其次，是否体内研究也同样受到影响。因乳铁蛋白可上调IGF-1[9]，那么要证明乳铁蛋白是通过调控IGFBPs来促进成骨细胞增殖的前提得先排除IGF-1的影响。此外，IGFBPs具有独立作用[10]，即不依赖IGF-1的影响成骨细胞的作用，那乳铁蛋白是否只是通过影响IGFBP单条途径影响成骨细胞的增殖也未可知。想要回答以上问题，可继续进行体外研究乳铁蛋白对IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5蛋白表达的影响，另外通过体内研究进一步佐证。实验发现，乳铁蛋白抑制了IGFBP-4 mRNA的表达，则可通过腺病毒过表达IGFBP-4以进一步确定IGFBP-4乳铁蛋白是否通过抑制其表达而达到促进成骨细胞增殖的作用。此外，为排除IGF-1促成骨细胞的作用，可利用基因沉默技术，沉默IGF-1来证实。

综上所述，本研究证实乳铁蛋白影响IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表达，若能进一步研究出乳铁蛋白调控骨量和影响成骨细胞增殖与IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5之间的关系，将给临床提供更多治疗骨质疏松的药物靶点。

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（收稿日期：2014-08-06 本文编辑：郭静娟）