核糖体的结构和功能研究

[摘要] 2009年诺贝尔化学奖的获奖者在原子水平上构建起核糖体的晶体结构,揭示了核糖体合成蛋白质的关键机理:肽键生成机理和蛋白质翻译的高精确性。核糖体结构和功能研究对开发新抗生素具有重要的意义,是一项具有重要现实意义的研究。

[关键词] 诺贝尔化学奖 核糖体结构 功能 抗生素

2009年10月7日,瑞典皇家科学院将诺贝尔化学奖授予美国科学家文卡特拉曼•拉马克里希南(Venkatraman Ramakrishnan)、托马斯•施泰茨(Thomas A. Steitz)和以色列科学家阿达•约纳特(Ada E. Yonath)3人,以表彰他们在“核糖体(Ribosome)的结构和功能研究”中所做出的贡献。

核糖体是最重要的细胞器之一,被喻为细胞的蛋白质合成工厂。三位科学家利用X射线结晶学技术绘制出3D模型来标识组成核糖体的无数个原子的空间位置。这项研究将遗传信息在生命体中的复制、转录和翻译三部曲中最后一步进行了解读――核糖体如何将生命体中信使RNA(mRNA)上的遗传信息转变为蛋白质。这是继1962年詹姆斯•沃森(James•Watson)、弗朗西斯•克里克(Francis•Crick)等人因“对DNA分子的双螺旋结构的研究”、2006年罗杰•科恩伯格(Roger Kornberg)因“在分子水平研究DNA的遗传信息怎么转录到mRNA”分别获得诺贝尔化学奖之后,再次在该研究领域赢得诺贝尔化学奖,这项研究使人们对生命活动的本质有完整的解读。

1 核糖体的结构和功能

核糖体呈椭圆颗粒状,大小约15～20 nm,是由蛋白质和RNA共同组成的非膜结构细胞器。真核生物和原核生物核糖体都由一大一小两个亚基组成;但是亚基的结构很复杂。以细菌生物为例,其核糖体的小亚基由20个不同蛋白质分子绕着一个大RNA分子构成,而大亚基由约33个不同的蛋白质分子围绕一大一小两个RNA分子组成。

核糖体的唯一功能是合成蛋白质。简单来说,核糖体就是在mRNA上逐渐移动,以此为模板从周围的20种氨基酸中挑选出合适的氨基酸,借助转运RNA(tRNA)实现氨基酸的转运,把它们粘接成氨基酸链(多肽链)。在这个过程中,mRNA与小亚基上相应位点结合,tRNA携带对应的氨基酸依次进入核糖体的3个tRNA结合位点:A位点、P位点、E位点,如图1所示。其中,A位点又称氨酰基位点,是tRNA和对应氨基酸结合生成的氨酰-tRNA与mRNA进行密码子\\反密码子配对的位点。P位点是肽酰基位点,与A位点紧邻,是不断增长的肽酰-tRNA的结合位点。其中,蛋白质合成的关键步骤――肽酰转移发生在A、P位点上,即A位点上的氨基与延伸中的肽链缩合形成肽键,P位点上的tRNA变成空载状态,而A位点产生新肽酰-tRNA。接着,紧挨着P位点的E位点接受P位点上的空载tRNA,再将其释放出核糖体,而新肽酰-tRNA进入P位点,A位点腾空准备迎接下一个新的氨基-tRNA。在整个翻译过程,核糖体表现出极高的精确性,从而确保了生命表征的完整有序。

由此不难看出,核糖体合成蛋白质的核心是肽键的生成,但是核糖体如何催化肽键的合成,其化学机理是什么?此外,核糖体如何实现整个翻译过程的高精确性?这两个核心问题直到核糖体高分辨率结构获得后才慢慢有了答案。

2 核糖体结构和功能研究的若干突破

2.1核糖体结构的突破性研究

早在20世纪80年代以前科学家们就已经知道,核糖体是由一大一小两个亚基组成的。但是,直到2000年科学家才得到第一张可以确定核糖体中原子位置的晶体结构图。科学家对核糖体结构的研究经历了20多年的艰辛探索。

X射线衍射分析是得到核糖体精细结构的必要手段,但这要以高质量晶体的获得为前提。因此,该研究的首要任务就是获得高纯度的核糖体晶体,然而这绝非易事。首先,核糖体包含无数原子,没有利于晶体化和结构确定的对称性,是最复杂的蛋白质/RNA复合物之一,获取高质量的核糖体晶体本身就是一个艰难的任务。其次,核糖体极不稳定,当环境条件和生理状态的改变会发生聚合或解离。核糖体本身的这些特性使得许多结晶学家直到70年代对核糖体能否结晶仍表示怀疑。但是约纳特却迎难而上,在70年代末踏上艰难探索核糖体结晶的孤独之旅,为核糖体结构研究做出了开拓性的贡献,成为诺贝尔化学奖历史上的第四位女性获奖者。

基于核糖体自身的特点,约纳特在经过不下2.5万次的尝试后,终于在1980成功地找到核糖体较为稳定的生物――一种生活在高温条件下的嗜热细菌(Geobacillus Stearothermophilus),获得了第一个可以用于结构分析的核糖体大亚基晶体,这为核糖体的结构研究做出了首要突破。随后,约纳特发现死海的嗜盐细菌(Haloarcula Marismortui)的核糖体晶体在X射线作用下较稳定。另外,为了解决核糖体在X射线下的稳定问题,约纳特开拓性地使用低温晶体法(Cryocrystallography)将核糖体晶体冻结在液氮产生的-196℃下。这一系列的发现解决了核糖体晶体质量问题,而后约纳特遇到了新的问题――核糖体晶体X射线衍射图的相位角问题。约纳特采用多重同晶置换法处理核糖体晶体,使晶体表面附着重原子(如汞),由于核糖体原子众多,这个尝试没有成功。约纳特的这些研究工作解决了核糖体高质量晶体制备的问题,为核糖体的结构研究打下了基础,也吸引越来越多的研究者加入,其中包括来自美国耶鲁大学的施泰茨和来自英国剑桥大学的拉马克里希南。

施泰茨对约纳特遇到的相位角难题进行研究。他利用电子显微镜专家Joachim Frank用低温电子显微镜(Croy-EM)制得的核糖体大亚基晶体图像,结合使用多对同晶置换法(Multiple Isomorphous Replacement)和反常散射法(Anomalous Scattering Techniques.),于1998年突破了相位角问题。随着问题的突破,施泰茨获得第一张核糖体大亚基晶体图像,不过分辨率只有9(是长度单位,1=10-10m=0.1nm)不足以显示出每个原子,但这个进步说明获得核糖体亚基及整个核糖体的高分辨率晶体图像已经为期不远了。

接下来,三位诺贝尔奖获得者通过不断改善晶体提高图片精确度,最终同时获得高分辨率的晶体结构图。2000年,施泰茨和同事报告大亚基(H. marismortui)的2.4分辨率的晶体结构,拉马克里希南和同事研究得到小亚基(T. thermophilus)的3.0分辨率晶体结构图。2001年,约纳特和他的同事获得了3.2分辨率小亚基(T. thermophilus)结构,以及革兰氏阳性耐辐射球菌的大亚基的高分辨率结构图。然而,核糖体整体的高分辨率(3.5)晶体结构图(如图2所示)则是于2005年由坎特(Cate)和同事研究获得的。这些核糖体的高分辨率结构图使人们能够知道核糖体中每个原子的位置,并找到核糖体合成蛋白质的活性位点,如tRNA的三个结合位点:A位点、P位点、E位点,以及合成过程中的关键原子等,这利于核糖体研究的进一步深入。

2.2 核糖体功能研究的突破进展

(1)肽键合成机理的研究

当大亚基的高分辨率结构获得之后,核糖体催化肽键的生成机理研究被更多的人关注,但是研究却没有得到预期的突破。直到施泰茨与其他研究者合作,将核糖体结构研究与生物化学研究法及计算化学研究法结合起来,才最终获得研究的成功。

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生物化学的研究数据表明,肽键的合成是一个熵驱动反应,不是焓驱动反应,基于此,有研究者推测肽键生成反应中反应物和周围的水分子相互作用形成一个氢键网,氢键网的存在大大降低了核糖体催化肽键合成反应的活化自由能。其中,核糖体催化肽键生成的机理具体如图3所示,P位点的肽酰-tRNA的腺嘌呤(A76)上的2’-OH通过氢键扰动A位点上的氨基,使A位点的氨酰-tRNA的氨基(-NH2)进攻肽酰-tRNA的酯键(-COO-),使酯键断开与其生成肽键(-NHCO-)。在这个过程中,2’-OH借助氢键网将质子提供给P位点腺嘌呤(A76)3位碳上由于酯键断裂产生的亲核氧,同时借助氢键网接受来自A位点氨基上的质子,形成新的2’-OH。大量研究表明,在反应过程中P位点中的2’-OH对反应有巨大的影响,当2’-OH不存在时,肽键的生成速率降低6个数量级。施泰茨和同事通过晶体学的高超手段验证了P位点肽键-tRNA中腺嘌呤(A76)的2’-OH的质子在肽键合成中的重要作用,以及氢键网的存在。

(2)核糖体催化蛋白质合成的高精确性

对于核糖体在蛋白质合成中表现出的高精确性,先前的研究者给出了不少解释,例如,核糖体通过提高同族与非同族密码子-反密码子对的标准吉布斯自由能变的差值(G)来提高翻译的精确度;翻译中氨基酸和密码子的配对存在密码配对的摆动性,即mRNA和tRNA的前两对碱基严格遵守碱基配对原则,第三对碱基有一定的自由度,可以“摆动”,从而使某些tRNA可以识别多个密码子。但是,核糖体提高G°是怎么实现的?配对过程中,第三个碱基对为什么有摇摆性?拉马克里希南基于小亚基的高分辨率结构,通过对抗生素药物作用下的小亚基的晶体结构的研究对这些问题逐一作出了解释。

拉马克里希南在对抗生素药物(如,巴龙霉素等)作用下小亚基的晶体结构研究中,发现当核糖体与正确配对的三元复合物(氨酰-tRNA/EF-Tu/GTP)联结(如,苯丙氨酸tRNA与mRNA在A位点相互作用)会诱导小亚基的某rRNA(16S RNA)上的三个保守碱基A1492、A1493和G530发生位置的变化,进而与密码子-反密码子(Anticodon -Codon)碱基对通过形成氢键检测配对是否正确,具体如图4所示。其中,A1493与密码子-反密码子的第一个碱基对形成氢键而控制第一个碱基对的几何构象,A1492和G530以同样的方式共同控制第二个碱基对,但密码子-反密码子对的第三个碱基对则没有受到这种控制。这个过程解释了核糖体如何通过tRNA诱导三个保守碱基A1492、A1493和G530控制密码子-反密码子的前两个碱基对的几何构型,同时也在结构上解释了核糖体在翻译过程中为什么第三对碱基有摇摆性。

(A)密码子-反密码子的第一个碱基对(U1-A36)的几何构型被A1493控制;(B)密码子-反密码子的第一个碱基对(U2-A35)的几何结构被A1492和G530控制,(C)密码子-反密码子的第三个碱基对(U3-G34)的几何结构没有受到这种控制,从而表现出第三位碱基的摇摆性。

此后,拉马克里希南与同事研究发现核糖体与一个能正确配对的三元复合物(氨酰-tRNA/EF-Tu/GTP)联结,除了诱导碱基A1492、A1493和 G530发生位置的变化,还使亚基发生大的构象变化――从开放构象转变成闭合构象(如图5所示),而快速引发肽键合成的一系列反应,这再次展现了核糖体翻译合成蛋白质的高精确度。此外,研究还发现核糖体亚基结构的闭合构象是通过核糖体蛋白S12来控制,而开放构象通过核糖体蛋白S4和S5控制。其中,某些诱导药物(如巴龙霉素)可以使S4和S5发生突变,闭合构象被稳定,使得即使是非正确配对的三元复合物附着在核糖体上也能发生肽键合成反应的一系列反应,翻译的精确度降低。而如果控制使S12发生突变,则开放构象会被稳定,反应不被引发,肽键合成的精确度提高。这是抗生素对核糖体精确度产生影响的机理。

3 核糖体结构和功能研究的意义

第二次世界大战后,抗生素被广泛用来治疗细菌感染,极大改善了健康状况。但是,60年后的今天,由于病菌感染而死亡的人数逐年上升。在美国,现在每年死于细菌感染的人数约90万,而20年前只有约13000人。由于致病菌的抗药性导致降低抗生素药物有效性的大大降低已经成为一个严峻的问题,开发新抗生素药物已经刻不容缓。以病菌的核糖体为靶向的抗生素药物占抗生素的大部分,利用核糖体的高分辨率结构针对性地设计新的高效核糖体靶向抗生素来对付抗生素的抗药性充满了无限可能。

核糖体的结构和关键突变位置的定位是利用结构药物设计方法(Structure-Based Brug Design,SBBD)研发抗生素的关键。一方面,核糖体的大亚基和小亚基与多数抗生素的联结方式已经可以通过高分辨率结构图像展现出来,这在一定程度上展示了解抗生素药物是如何与核糖体作用产生出抗药性,而为新抗生素的设计提供指导。另一方面,核糖体的高分辨率结构,特别是关键活性部位的高分辨率结构的发现和研究对抗生素研究有决定性意义,例如研究发现致病菌核糖体的50S亚基的肽键合成位点是大多数抗生素药物结合部位,则可对作用于该部位的各种物质进行研究开发出作用于此部位的新的抗生素药物。另外,最为关键的是,高分辨率结构能够更有效地定位致病菌中关键性突变,从而有效地改进、研究新的抗生素药物,解决抗生素的耐药性问题。

核糖体晶体结构的研究,使人们对生命活动中至关重要的蛋白质合成有更为本质的了解。此外,三位科学家所绘制的核糖体结构模型已经被广泛地用于新抗生素的研制,从而减少患者的病痛和拯救生命。就如诺贝尔化学奖评选委员会在介绍获奖成果时所说的“有关核糖体结构和功能的研究能够被迅速应用到实际中”,这一项极具现实意义和应用价值的研究。

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