精子形态分析标准化研究进展

黄茜 许常龙 史秋雯 2019-10-06 版权声明 举报文章

[摘要] 精子形态是评价男性生育力的一项重要参数,但精子形态分析本身存在许多不足,由于质量保证措施常被忽略,实验室室间检验能力验证计划还未推广,导致实验室内部和不同实验室间的分析结果具有广泛差异性。精子形态分析需要建立完善的检测技术体系和相应的质量控制体系,本文对近年来国内外有关精子形态分析标准化的研究进展进行综述。

[关键词] 精子形态;标准化;质量控制;精子

[中图分类号] R69 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2013)06(c)-0020-03

精子形态作为评估男性生育潜能的指标始于20 世纪初,从那时起用何种形式评估正常或异常精子一直是一个持续争论的领域。精子形态学分析体系是随着染色技术的发展和畸形精子分类体系的形成而建立的。有研究认为精子形态是衡量男性生育力的最好指标[1]。正常精子形态率下降是睾丸生理机能不良的一种反应,任何精子形态上的缺陷都将导致其功能下降,影响男性生育力[2]。但精子形态分析本身存在许多不足,如分析标准各异、染色方法不同、检测人员的主观性、检测分析未能标准化等[3],造成实验室内部和不同实验室间的分析结果具有广泛的差异性,从而导致分析结果的不准确和不可信。因此,精子形态分析需要建立完善的检测技术体系和相应的质量控制体系。近年来,不少男科专家对精子形态学分析进行了标准化研究[4-6]。本文对国内外有关精子形态分析方法与质量控制体系研究进展进行综述。

1 精子形态分析的标准化

1.1 精子形态分析涂片的制备方法

涂片制备有两种方法,一种方法是取精液直接涂片,另一种是将精液洗涤离心去除精浆后涂片。精液洗涤后涂片是用CASA进行精子形态分析时普遍使用的方法[7]。因其染色后背景着色较浅,精子分散度好,更有利于形态分析。对于黏稠或液化不良的精液,通过吸管机械吹打、洗涤去除精浆后,得到的涂片质量效果也较好。但有研究表明,洗涤时相对离心力的选择对精子形态有影响,高相对离心力增加精子头部空泡畸形[8],可能的原因是离心时间和离心转速均能增加活性氧的生成。提示洗涤制备涂片时要选择适宜的离心力及离心时间。

1.2 精子形态分析的染色方法

1.2.1 未经染色法 Oral等[9]研究认为,未经染色法仅适用于分析形态正常的精子。也有学者认为,这种方法误差很大,不能反映精液的质量和真实情况[10]。对于不染色的精子,很难观察到其细微结构上的缺陷,目前实验室已较少采用此方法。

1.2.2 染色方法 目前国内外用于精子形态分析的染色方法主要有巴氏染色法、Diff-Quik染色法、Giemsa染色法、Bryan-Leishmen染色法、Shorr染色法等。Gimesa染色易于区分白细胞类型,但不能对精子提供可靠的对照。Bryan-Leishmen染色法精子各部位染色清晰,易于区别白细胞与未成熟生精细胞,但该方法试剂制备复杂,染色步骤繁琐。WHO手册中推荐使用巴氏染色法和Diff-Quik染色法,巴氏染色法可能够较好地分辨精子形态和区分其他细胞,清晰染色精子各部包括细胞核、核仁及细胞质,使精子内部结构对比明显,应用此方法可以长期保存标本,但该方法步骤繁琐,耗时较长。Diff-Quik染色法适用于CASA分析,操作简单快速,但涂片背景着色较深,同时有可能会增大精子头部。研究表明,巴氏染色法和Diff-quik染色法的精子形态评估结果一致,对正常形态精子评估具有高度正相关性[11-12]。

近年来出现的染色玻片法,不需经过涂片和干燥等步骤。染色玻片上均匀分布着一定比例对细胞结构有特殊亲和性的染料(新亚甲蓝 N和紫罗兰甲酚酯,比例为1∶2.1), 将液化的精液直接滴于玻片上,作用几分钟即可完成染色步骤。而传统涂片和干燥方法有时会破坏细胞结构。染色玻片法操作时间短,精子轮廓清晰,非精子细胞成分易于判读,效果与巴氏染色法相似[13]。

1.3 精子形态分析标准

Cary于1930年首次提出人类精子形态在其穿透宫颈黏液过程中起重要作用,这一报道揭开了精子形态学研究的序幕。严格的精子形态评估方法(Tygerberg标准)是1987年由Menkveld[14-15]提出并在1990年进行了详细描述。形态正常精子的定义依据的是来自性生活后子宫颈黏液或卵子透明带表面回收的精子得到的生物学证据,这些精子大部分表现出均一的形态,精子头部形态会发现一些微小的生物学变化,但认为这些变化是正常的。严格评估标准的一个重要方面是必须保持这些正常生物学变化的范围尽可能小,因而认为所谓“临界的”或“轻微异常的”头部形式均是异常的。

目前全世界承认的关于精子形态分析的金标准是WHO手册,该手册从第3版开始引进了评估精子形态的严格标准,第4版[16]则完全采用严格评估(Tygerberg)方法。随着WHO手册的不断修订,精子形态正常参考值也在发生显著变化:手册第1版为50%,到第3版为30%,第4版仅说明当正常形态精子百分率低于15%时体外受精率显著降低,没有给出正常参考值。目前,第5版[7]对可育人群的正常精子形态百分比使用第5百分位数,参考值修订为4%。

Keel[3]调查表明,WHO手册并没有被实验室普遍接受,各实验室间执行着不同的标准,使得一个实验室与另一个实验间结果难以进行比对。研究表明,对精子形态学的不同解释取决于实验室评估正常形态学所用的标准[17]。决定精子形态学分类差异的不是标本制样误差,而是主要取决于对正常和异常的判断标准[18]。

1.4 精子形态分析的方法

1.4.1 人工计数分析 目前,精子形态分析的主要方法是传统的光学显微镜下人工计数分析,在一定程度上依赖检测人员的水平,因此结果受主观因素影响较大。主要由于在显微镜下人的肉眼很难准确区别与精子形态相关的参数尺寸,检测人员的长时间用眼疲劳、检验技术水平及经验参差不齐等都会造成结果的误差[19]。

1.4.2 计算机辅助分析 计算机辅助分析(computer-aided semen analyzers,CASA)对捕捉到的精子图像进行多种参数的测量与计算,根据内置标准得出客观判断。CASA系统可把精子头部和中段分类为正常或不正常,还可给出头部和中段尺度、头部椭圆率和匀称性的均数、标准差和中位数,以及对精子顶体区进行测量,可检测出肉眼无法发现的非正常形态精子。因此,CASA分析借助计算机将精子形态量化,是精子形态检测标准化发展方向之一。

CASA分析也存在诸多问题尚待解决,由于精子染色过深或过浅均可导致计算机系统不能精确地识别,造成形态参数测量与计算错误; 标本涂片的处理、精子密度、分布不均一性等都会影响计算机分析精子形态参数的能力;计算机也有可能将与精子头大小相似的细胞碎片、染料颗粒或其他细胞误判为精子;另外,不同的染色方法也可能会使精子头部形态参数计算错误[20]。在计算机图像分析的同时进行人工修正,可提高CASA分析的检测质量[19]。

2 精子形态分析的质量控制

2.1 内部质量控制的措施

实验室应该执行有效的室内质控和质量保证计划,以保证报告结果的准确性和可重复性,并及时分析误差来源。一方面,根据 WHO手册的标准建立实验室精子形态分析的操作手册,并严格遵照其执行。即每一标本制作 2张以上涂片检测,结果在检测差异属于误差允许范围内才可接受; 检测每张涂片计数精子数要求至少200条,以减少结果的随机误差。另一方面定期评价技术人员检测水平。精子形态学的质量控制可用照片、录像带或已固定染色或未染色的玻片,也可从日常检测中选择已经评估过的一些形态涂片永久保存。Cooper等[21]提出,选择有正常和异常精子形态学百分率的标本,制备大量的精子涂片,将它们于4℃下贮存,然后定期染色和分析。每一标本正常形态的靶值可通过20张涂片的平均百分率确定,技术人员的检测水平可通过绘制Levey-Jennings质控图来监测。

徐威香等[6]对制备精子形态分析室内质控品进行了尝试,将检测后剩余精液中的精子经过回收和加工,制备成精子质控品,经室内质控观察,其形态完好,色彩清晰,稳定性至少达7个月。

2.2 外部质量控制的措施

目前,国内外均未能开展精子形态分析的大规模、多中心的室间质控。由于男科实验室检测缺乏标准化,使不同实验室的分析结果难以比较,可能导致患者在不同的实验室其诊断结果不同。Keel等[17]研究发现,在比较实验室间精子形态学结果时存在显著的差异性,在参加实验室间 CV变化为15%~93%。进行外部质量控制可行的方案是,首先对所有检测人员统一检测方法与分类标准,可通过集中培训的方式。检测方法与分类标准统一后,中心实验室发放质控标本对各实验室检测人员进行连续监控。外部质控关键在于培训及质控标本的选取,要保证标本具有典型性及一致性。

3 展望

由于精子形态人工计数分析主观性较强,因此,依靠计算机辅助分析将精子形态量化,可能是其标准化的发展方向的最终选择。精子形态分析中技术要求高、操作难以标准化,因此必须进行质量控制以发现并纠正系统误差和随机误差,以保证分析结果的参考价值。研究证实,提供完全的理论背景及反复的实践训练,结合内部质控和外部质量控制措施,对提高实验室人员的技能高度有效[22]。但是目前这类训练太少,且对于何种方法最有效尚未达成共识[23]。

精子形态分析必须建立完善的检测技术体系和相应的质量控制体系,以保证为患者和医生提供准确、可重复和有临床意义的分析结果。应采用公认的WHO操作标准将精子形态分析操作和报告结果标准化,规范内部质量控制措施,并从操作手册建立、仪器定期校准、人员培训等方面合理地实施质量控制。同时,鼓励实验室通过参加外在质量评估项目,以逐步提高检测结果的一致性和可信性。

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