时间：2022-10-06 07:41:09
张 弘 王 真 蔡宛如 沈华浩
摘 要：目的：探讨中药复方清肺止哮汤对哮喘小鼠气道炎症和外周血Th1/Th2平衡的影响。方法：用卵白蛋白(OVA)致敏、激发建立哮喘小鼠模型。末次抗原激发后48h收集血、支气管肺泡灌洗液(BALF)和骨髓标本。计数细胞总数和嗜酸性细胞(EOB)，检测外周血Th1/Th2反应，以及肺组织学检查。结果：清肺止哮汤可明显减少BALF中Eos数，能使肺组织中细支气管、血管周围的Eos浸润和黏液的过度分泌得到控制，但和布地奈德(BUD)组相比仍有显著性差异(P＜0.01)。经中药干预后外周血总的CD+3T细胞表达IL－4的细胞群/表达IFN－γ的细胞群与OVA组相比有显著性差异(P＜0.05)，其中Tc2/Tcl，Th2/Th1呈明显下降趋势。结论：清肺止哮汤能部分抑制哮喘小鼠气道炎症，并使外周血CD+3T表达IFN－γ的细胞群增加，对于哮喘时Th1/Th2失衡具有一定的纠偏作用。
关键词：哮喘；动物模型；嗜酸性粒细胞；清肺止哮汤；Th1/Th2平衡
中图分类号：R－33 文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2007)07－1475－04
哮喘是由嗜酸性粒细胞(Eos)活化并在肺内募集所导致的气道慢性炎症，并伴有气流的可逆性受限和气道高反应性，其中最主要的免疫异常是Th1/Th2平衡失调，Th2细胞及其所释放的细胞因子在诱导哮喘特征性病理生理中起了关键作用。随着气道炎症学说的确立，抗炎治疗得到了广泛应用并在临床上取得了良好疗效。吸入激素具有明显的抗炎作用，但不能从根本上逆转哮喘的自然病程，不能纠正潜在的免疫失调，长期使用可引起全身性的不良反应。传统的中医中药已引起了越来越多学者的广泛兴趣，本研究通过建立稳定的小鼠哮喘模型，观察中药复方对哮喘气道炎症的抑制作用，并进一步运用流式细胞仪测定外周血细胞Th1/Th2平衡的变化，以探讨其作用机制。
1 材料和方法
1．1 实验试剂和仪器
卵白蛋白(OVA，美国Sigma公司)，小鼠外周血流式细胞检测试剂(包括Anti－mouseCD3e。Anti－mouseCD8a，Anti－mouse IL－4，Anti－mouse IFN－γ，美国BeetonDickinson公司产品)，蛋白转运抑制剂莫能霉素、刺激剂佛波酯、离子霉素、固定及破膜剂(美国Sigma公司)，佐剂液态铝(美国PIERCE公司)，布地奈德雾化液(无锡阿斯特拉公司产品)。仪器主要有便携式超声雾化器，石蜡切片机，低温离心机，光学显微镜，流式细胞仪。
1．2 实验药物及制备
中药复方由野荞麦根30g，黄芩15g，浙贝20g，皂角刺6g，白芍12g，川芎12g，桑椹子15g，补骨脂15g，黄芪15g等组成，委托浙江中医药大学中药系制剂室煎制成含生药2．5g/mL煎剂备用，整个实验过程均采用同一批制剂。
1．3 动物模型制作及分组
6－8周龄C57BL/6小鼠，雄性，体重18－22g，购自中科院上海动物中心公司。随机分为4组，每组6－8只：抗原卵白蛋白致敏激发组(OVA组)、正常对照组(NC组)、布地奈德处理组(BUD组)、中药复方处理组。OVA组、BUD组及中药处理组的小鼠分别于第O和14天腹腔注射OVA致敏液O．2mL/只(含OVA80lag)，于第24、25、26天，分别给予1％OVA雾化液10mL超声雾化进行抗原攻击，每天1次。正常对照组则以生理盐水代替OVA以同样的方法致敏激发小鼠。中药组从小鼠第1次致敏当天起，以灌胃的方式给药，每天1次，0.4mL/次，共26天，BUD组则从致敏后第23天起每天1次在乙醚吸入麻醉下予鼻腔内滴注BUD，剂量为350μg/kg，共4天。第28天处死各组小鼠，收集标本。
1．4 观察指标与方法
1．4．1 BALF动物以2％戊巴比妥腹腔麻醉后在颈前暴露气管做横切口，插入改良的18G气管插管针。用0.7mLPBS液灌洗3次，回收BALF，确保回收率在80％以上。离心后收集细胞作涂片，亚甲基蓝一伊红染色后计数细胞总数和Eos数。
1．4．2 骨髓悬液以1.5mL HBSS液缓慢反复多次冲洗股骨腔，形成单细胞的混悬液。计数有核细胞总数，同时制备涂片染色后计数Eos数。
1．4．3 肺组织学检查右肺固定于10％的中性甲醛溶液中，石蜡包埋切片，分别行HE染色和PAS‘染色。
1．4．4 流式细胞术测定外周血细胞中Th1/Th2小鼠腹腔注射肝素抗凝，以2％戊巴比妥腹腔麻醉后沿胸骨剖开，抽取心脏血约0.7mL。取新鲜小鼠外周血0.5mL，运用三色流式细胞分析法检测外周血中Th1/Th2细胞平衡情况。
1．5统计学分，所有数据经SPSS10.0统计软件处理。各组资料以(x±s)表示，进行方差分析。P＜0.05作为显著性差异水平。
2 结 果
2．1 对BALF中细胞总数和Eos绝对值的影响
清肺止哮汤组BALF中细胞总数及Eos数明显减少，与OVA组相比均有显著性差异P＜0.01，见表1。对Eos的抑制率．达到了90％，对细胞总数的抑制率达到了49.8％。
2．2 对骨髓中细胞总数和Eos绝对值的影响
运用中药复方清肺止哮汤对骨髓中有核细胞总数及Eos数均无明显抑制作用，与OVA组比较，P＞0.05，见表2。
2．3 肺组织学结果
和正常组比较，抗原致敏激发后在细支气管和微血管周围有大量炎性细胞浸润，尤以Eos更为明显，PAS染色显示气道上皮细胞黏液分泌增加。给予中药干预后气道及血管周围Eos浸润得到明显抑制，气道黏液分泌得到了控制。经过BUD处理的小鼠，其肺组织中支气管和微血管周围未见Eos浸润，抗原诱导的气道炎症完全得到了抑制，和正常小鼠肺组织切片基本一致。
2．4 清肺止哮汤与激素的对比研究
经中药干预后BALF中细胞总数及Eos数，与OVA组相比均有显著性差异(P＜0.01)，经激素BUD干预后BALF中细胞总数及Eos数，与OVA组相比亦有显著性差异(P＜0.01)，同时清肺止哮汤BALF中细胞总数与BUD组比较无显著性差异(P＞0.05)，但是，Eos绝对数和百分比与BUD组比较有显著性差异(P＜0.05)，结合肺组织学结果，表明清肺止哮汤对哮喘小鼠气道炎症的抑制作用是不完全的，和激素比较有差异。中药对骨髓细胞总数不影响，而BUD明显抑制骨髓细胞总数。
2．5 对外周血Th1/Th2细胞平衡变化的影响
采用流式细胞分析法检测外周血中Th/Th2细胞，结
果发现在OVA组，CD+4细胞中Th2/Th1比值较正常对照组明显增加(P＜0.01)，显示了Th1/Th2平衡向Th2优势化，在正常对照组小鼠中Th1细胞比Th2细胞多。经中药干预后结果显示外周血总的CD+3T细胞，包括Tc与Th中表达IL－4的细胞群/表达IFN－γ的细胞群与阳性对照组相比有显著性差异(P＜0.01)，其中Th2/Th1、Tc2/Tc1比值呈明显下降趋势，但是与OVA组比较无统计学意义(P＞0.05)。
3 讨 论
支气管哮喘属于祖国医学哮证的范畴。临床上运用中医中药治疗哮喘有着悠久的历史，并且已有报道一些抗哮喘的中药具有良好的疗效。中医理论认为，哮喘的病因是由于先天禀赋不足，脏腑功能失调导致宿痰内伏于肺，再由外邪入侵、饮食失调、冷暖不当或情志不畅等外因而诱发。哮喘发作时，邪盛于肺，但疾病的根源则与肾和脾有关，肺为气之主，肾为气之根，肾虚则不能纳气，致使上下之气交接失常，加之痰饮搏结，则哮喘难平，日久肺气虚损，不能辅心行血，心气不足，心脉失畅而致瘀。因而肺肾气虚，痰饮内伏是其主要病机，根据其病理特点，笔者确立了益气补肾、清肺活血的治疗大法，并以此为原则遣药组成清肺止哮汤。方中黄芪具有益气固表作用，现代药理研究证明其含有多种化学成分，其中苷类有延长细胞存活，促进物质代谢，提高免疫功能等活性，桑椹子、补骨脂补肾纳气，辅黄芪益气化痰，黄芩、野荞麦根、浙贝、皂角刺清宣肺热化痰，白芍、川芎养血活血，诸药合用，共奏益气补肾，清肺活血之功效，以达标本同治，扶正祛邪之目的。
本研究通过C57BL/6哮喘小鼠模型，探讨了中药复方清肺止哮汤对气道炎症的抑制作用，结果显示：清肺止哮汤不仅能明显减少BALF中细胞总数和Eos数，而且还能减轻肺组织细支气管周围、血管周围的Eos浸润，减少黏液的过度分泌，但同时和BUD比较仍有差异，且BUD组肺组织中支气管和微血管周围未见Eos浸润，抗原诱导的气道炎症完全得到了抑制，表明清肺止哮汤对哮喘小鼠气道炎症有部分抑制作用，然而和激素相比，这种抗炎特性并不完全。其中原因还不清楚，但运用清肺止哮汤治疗哮喘至少能在某种程度上补充激素的抗炎作用，而至于联合应用这两种药物能否减少激素用量还有待于进一步研究。
随着对哮喘炎症机制、免疫机制的研究进展，越来越多证据表明，哮喘最重要的免疫学异常是Th1/Th2平衡失调，主要表现为以Th2细胞型免疫反应占主导。本研究运用三色流式细胞分析法从细胞水平观察了哮喘小鼠外周血中Th1/Th2平衡情况，以及清肺止哮汤干预后对起其平衡变化的影响。结果发现在OVA组，Th细胞中Th2/Th1较正常对照组明显增加，显示了哮喘小鼠Th3/Th2平衡向Th2优势化，在正常组中Th1细胞比Th2细胞多。清肺止哮汤干预后结果显示外周血总的CD+3T细胞，包括Th与Tc中表达IL－4的细胞群/表达IFN－γ的细胞群与阳性对照组相比有显著性差异，其中Th2/Th2、Tc2/Tc1比值呈明显下降趋势。该结果表明经清肺止哮汤处理后使得OVA致敏激发小鼠外周血中CD+3T表达IFN－γ的细胞群增加，并且是通过CD+8T细胞与CD+4T细胞共同作用来实现的，该药对于哮喘时Th1/Th2失衡具有一定的纠偏作用。