唾液富组蛋白抗白念珠菌作用的研究

【关键词】 唾 液； 富组蛋白； 白念珠菌

1 概况

富组蛋白(histidine rich protein,HRPs或histatins)是一族存在于灵长类动物腮腺和?下腺分泌物中富含组氨酸的小分子、阳离子多肽［1～3］。现有研究表明：HRPs具有多种生物学功能，HRPs可能作为一组内源性多肽，在宿主非免疫防御系统中起重要作用，与多种口腔感染性疾病密切相关。近年来随着抗生素、免疫抑制剂的大量应用以及艾滋病的出现口腔念珠菌病的发病率急剧上升，并出现大量的耐药菌株，现有的抗真菌药物的副作用较大，急需找出一种具有较强的抗菌作用又对人体没有损害的物质。因此唾液富组蛋白的抗白念珠菌作用逐渐被重视。

2 唾液富组蛋白的发现、纯化

本世纪70年代采用四步色谱、酸尿淀粉胶及离子交换色谱技术检测出5种富组蛋白。80年代应用阳离子电泳技术可分离出7种富组蛋白，迄今为止，已从腮腺和?下腺中分离出至少12种富组蛋白，分别命名为HRPs1～12［1,2,4～6］。富组蛋白在人类唾液中的含量因不同人群、不同测定方法、不同的唾液流速而报告各异。

3 唾液富组蛋白的生物学作用

3.1 参与牙齿获得性膜的形成：磷酸化的富组蛋白（HRPs1）表现出对羟磷灰石表面有较大的吸附活性，其主要功能是获得性膜中的前体蛋白，是羟磷灰石晶体增长的抑制剂。该蛋白层位于釉质和牙菌斑之间，可防止菌斑细菌的代谢产物向釉质内扩散，也防止了釉质内钙和磷酸盐向牙菌斑内扩散，还可降低酸对釉质的腐蚀速度，对于抗龋有着重要意义［9］。

3.2 调节牙菌斑的PH值：HRPs分子中的咪唑环本身即有生理性的缓冲PH的作用。每分子的HRPs含有7个His、3～4个Arg和Lys，而Arg和Lys很容易被转化生成碱基，从而中和了致龋菌产生的酸，起到抗龋作用。

3.3 抑制变形链球菌：Mackay［7］等发现部分纯化的HRPs在体外能抑制主要的致龋菌—变形链球菌（S.mutans）的生长和生活力，且静止期的菌细胞比生长期的菌细胞对HRPs更为敏感。

3.4 抑制牙周病相关菌的凝集及其酶的作用：Murakami［8］等观察到合成的HRPs5对牙龈拟杆菌（B.g）和红细胞的凝集有很强的抑制作用。含有L-His,Arg和Lys残基的碱性肽在细胞的凝集过程中，可能通过静电作用，结合到B.g表面的粘附素上。因此，HRPs很可能对B.g在口腔的群集有抑制作用。Nishikata［10］等研究发现HRPs5能强烈地抑制由B.生的胰蛋白酶样蛋白酶的活性，其IC50=50nm；还能抑制梭菌蛋白酶的活性，其IC50=800nm；对胶原酶亦有一定的抑制作用。

3.5 抑制白念珠菌的作用：Pollock［3］等首次报道了HRPs混合物的抗白念珠菌的作用。Raj［11］等对HRPs5进一步研究发现HRPs5C端至少具有14个残基和a-螺旋体构象是重要的杀菌功能性片段和模式，最主要的功能性残基是15，18，19和21位的His；第11和13位的Lys以及第12位的Arg。

3.6 抗病毒作用：最近有学者报道，全唾液能抑制HIV-1的感染性。唾液并不具有较宽的抗病毒谱，所以这种作用对HIV-1是特异性的。但具体是哪一种或哪几种蛋白在起作用目前尚不清楚，但是HRPs的作用不能排除［17］。

3.7 中和细菌内毒素的作用：Sugiyama［12］等发现HRPs可以抑制细菌内毒素脂多糖（LPS）介导的鲎试剂的凝胶作用。各主要的HRPs中和LPS的能力为HRPs5>HRPs3>HRPs1，而它们分别含56%、47%、36%的碱性氨基酸残基。推测带正电的氨基酸残基在这种作用中起关键作用。国内的报道也证实了这一点。

3.8 诱导肥大细胞释放组胺：Sugiyama［13］等实验发现HRPs3和5具有相同的诱导肥大细胞释放组胺的活性，而HRPs1却只有很小的作用。因此，HRPs5的结构似乎在组胺释放中起重要作用，但其机制尚不清楚。

4 唾液富组蛋白的结构及其抗白念珠菌作用机制

众所周知，蛋白质分子的结构决定其生物学功能。Raj［11］等学者认为HRPs抗白念珠菌的特性与其氨基酸序列有关。他们将：HRPs5Asp-Ser-His-Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Gly-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr）及其残基片段1-16（N16）、9-24（C16）、11-24（C14）、13-24（C12）、15-24（C10）和7-16（M10） 分别与不同浓度的白念珠菌作用，检测其抗白念珠菌活性的能力。实验结果表明：天然的与人工合成的HRPs5，C16和C14有较强的抑制白念珠菌生长的能力，而且HRPs5与C16的抗白念珠菌的活性基本一致，而同样含有16个氨基酸的N16抗白念珠菌的活性远远低于C16。这一结果提示HRPs5的抗白念珠菌的功能区位于羧基端。同时他们还发现这些片段发挥生物学功能的最小长度为12个氨基酸残基，虽然在HRPs3-10中都具有Lys-Phe-His-Gly-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr相同的12个残基，但是C12的抗白念珠菌活性远远低于HRPs5，一旦将C12延长为C16，则其与HRPs5具有相同的抗白念珠菌活性。Dalbey［14］等认为正电荷残基在膜蛋白质局部起重要作用。膜蛋白质的正电荷残基可以与膜的磷脂头通过静电力结合。这样一来HRPs5的C16残基既可以通过氢键与膜结合，又可以通过氨基端和羧基端的正电荷与磷脂头静电力结合，这种膜结合蛋白就可以发挥起生物学作用。

5 影响唾液富组蛋白抗白念珠菌作用因素

①富组蛋白浓度对抗白念珠菌活性的影响。②PH对HRPs抗白念珠菌活性的影响。③白念珠菌的生长环境中营养状况的影响。④环境中的离子浓度的影响。⑤唾液的蛋白分解作用。

6 腺病毒介导富组基因治疗白念珠菌感染

O’connell［15］将富组多肽基因3（histatin3）在复制缺陷腺病毒介导下成功在体内外涎腺上表达。体外实验中将人类富组多肽基因3（AdcMVH3）转移到人类肾上皮细胞（293细胞）、大鼠颌下腺上皮细胞（SMIE）及人类颌下腺细胞（HSG），均有明显的富组多肽蛋白分泌至培养基中，用转基因培养基进行杀菌实验表明：120min内，可将90%的白念珠菌杀灭，且对AIDS患者感染的耐氟康唑的白念珠菌仍有显著的杀灭作用。大鼠体内实验用腺病毒介导富组多肽基因经导管感染颌下腺后，腺体唾液中的富组多肽平均高达302μg/ml，而未感染的大鼠颌下腺唾液中测不到人的富组多肽。表明经颌下腺富组蛋白基因转移，腺体表达后，其合成蛋白多分泌至唾液。从而可用来治疗相关的口腔疾病。进一步的体内实验已在白念珠菌感染的动物模型（兔、猴）进行，人类临床应用也在拟定中。

7 唾液富组蛋白抗白念珠菌作用的临床应用前景

Santarpia［16］等人用经过消毒的人唾液HRPs3、HRPs5溶液治疗6例义齿性口炎患者1周，结果发现HRPs减少了上颌义齿组织面的白念珠菌数量。近年来随着抗生素、免疫抑制剂的大量应用以及艾滋病的出现口腔念珠菌病的发病率急剧上升，并出现大量的耐药菌株。人们迫切需要找到一种有效、毒副作用低且廉价的药物应用于临床治疗，基因技术的飞速发展是这一愿望有可能得以实现。因此HRPs的抗白念珠菌作用的临床应用前景十分广阔。

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