浸润性乳腺癌中14―3―3σ蛋白的表达与ER、PR的相关性研究

[摘要] 目的 探讨浸润性乳腺癌组织中14-3-3σ蛋白的表达与雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）的相关性。 方法 选择2012年12月～2014年10月重庆市公安消防总队医院手术切除的浸润性乳腺癌组织标本55例及其相应的癌旁正常组织31例为研究对象，分别将其作为浸润性乳腺癌组织组和正常乳腺组织组。采用免疫组化SP法检测乳腺组织中14-3-3σ蛋白及ER、PR的表达情况；采用Pearson相关系数分析14-3-3σ蛋白表达水平与ER、PR的相关性。 结果 浸润性乳腺癌组织14-3-3σ蛋白及ER阳性表达率明显低于正常乳腺组织，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；浸润性乳腺癌组织PR阳性表达率与正常乳腺组织比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；浸润性乳腺癌组织中，14-3-3σ蛋白阳性表达率明显低于ER、PR，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；正常乳腺组织中，14-3-3σ蛋白、ER及PR表达情况比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。不同年龄、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移情况的浸润性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白阳性表达率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；不同TNM分期、组织分型、分化程度、PR及ER表达情况的浸润性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。Pearson相关性分析显示，14-3-3σ蛋白与ER阳性表达呈正相关（r = 0.3334，P < 0.05），14-3-3σ蛋白与PR无相关性（P > 0.05）。 结论 14-3-3σ蛋白可能参与浸润性乳腺癌的发生、发展和转移，14-3-3σ与ER的联合检测可成为乳腺癌患者预后判断的重要指标。

[关键词] 浸润性乳腺癌；14-3-3σ；雌激素受体；孕激素受体；相关性

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）05（b）-0090-04

Correlation study of 14-3-3σ and ER， PR expression in invasive breast cancer tissue

ZENG Chao

Department of General Surgery， Public Security Fire Corps Hospital in Chongqing City， Chongqing 400060， China

[Abstract] Objective To explore the relationship between the expression of 14-3-3σ and ER， PR in invasive breast cancer tissue. Methods 55 cases of breast cancer tissues with surgical resection from December 2012 to October 2014 in Public Security Fire Corps Hospital of Chongqing City and 31 cases of normal tissue adjacent to carcinoma were selected as invasive breast cancer tissue group and normal breast tissue group respectively. The expression of 14-3-3σ protein， ER and PR in breast tissues were detected by immunohistochemical （SP method）， and the relationship between the expression of 14-3-3σ and ER， PR were analyzed by Pearson correlation coefficient. Results The positive expression rate of 14-3-3σ protein and ER in invasive breast cancer tissue was significantly lower than that of normal breast tissue respectively， with statistical difference （P < 0.05 or P < 0.01）. The positive expression rate of PR in invasive breast cancer tissue was compared with normal breast tissue， with no statistical difference （P > 0.05）. The positive expression rate of 14-3-3σ protein in invasive breast cancer patients with different age， tumor size， axillary lymph node metastasis was compared respectively， with no statistical difference （P > 0.05）. The positive expression rate of 14-3-3σ protein in invasive breast cancer patients with different TNM stage， histological type， differentiation degree， PR and ER was compared respectively， with statistical difference （P < 0.05）. Pearson correlation analysis showed that 14-3-3σ protein was positively related with ER （r = 0.3334， P < 0.05）， but there was no correlation between 14-3-3σ protein and PR （P > 0.05）. Conclusion The 14-3-3σ may be involved in occurrence， development and metastasis of invasive breast cancer， detection of 14-3-3σ combined with ER can be an important index for prognosis of patients with breast cancer.

[Key words] Invasive breast cancer； 14-3-3σ； Estrogen receptor； Progesterone receptor； Correlation

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重影响女性身心健康，甚至危及生命[1]，因此，早期诊断、治疗及其预后一直是人们研究的焦点。肿瘤的发生、发展与细胞凋亡受阻、细胞周期失控等因素密切相关。特异性上皮细胞因子14-3-3σ被认为是一种新的肿瘤抑制基因，在细胞周期调控、细胞凋亡、DNA损伤、信号转导、细胞分化、细胞增殖中发挥重要作用。研究表明，14-3-3σ蛋白的失表达发生于人类多种肿瘤[2-6]。乳腺癌细胞中雌激素受体（estrogen receptor，ER）和孕激素受体（progesterone receptor，PR）水平的测定在乳腺癌的临床治疗和预后判断上的重要作用已被广泛接受并应用。本研究选择重庆市公安消防总队医院（以下简称“我院”）55例浸润性乳腺癌患者为研究对象，检测其14-3-3σ蛋白、ER、PR表达情况，并分析14-3-3σ蛋白表达与ER、PR的相关性，探讨14-3-3σ在乳腺癌发生、发展中的作用及机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年12月～2014年10月我院手术切除的浸润性乳腺癌组织标本55例作为研究对象，所有患者均经乳腺癌手术切除及组织病理学证实。所有患者均为女性，年龄28～70岁，平均（49.1±10.4）岁。根据WHO组织学分型及分级标准，其中浸润性导管癌35例，浸润性小叶癌20例；高分化癌13例，中分化癌29例，低分化癌13例；腋窝淋巴结转移40例，无腋窝淋巴结转移15例。根据国际抗癌联盟（IUCC）2003年乳腺癌TNM分期，其中Ⅰ期16例，Ⅱ期30例，Ⅲ期7例，Ⅳ期2例。另取同一患者的癌旁>5 cm处乳腺组织，且经病理证实为正常乳腺组织31例。所有患者术前均未进行放、化疗及内分泌治疗。所有患者均知情同意并签署知情同意书，且研究经我院医学伦理会批准通过。

1.2 主要试剂及仪器

鼠抗人14-3-3σ多克隆抗体、兔抗人14-3-3σ多克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），免疫组化SP试剂盒（DAKOenvi-sionDenMar），DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术有限公司），0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液，Harris苏木精，二甲苯，磷酸氢二钠（Na2HPO4），磷酸二氢钠（NaH2PO4）。CRM440切片机（日本Sakura公司），显微镜（日本Olympus公司），照相系统（日本Olympus公司），载玻片、盖玻片（盐城耀华玻璃仪器厂）。

1.3 方法

采用免疫组化SP法检测乳腺组织中14-3-3σ蛋白及ER、PR的表达情况，组织块10%中性甲醛固定后，石蜡包埋，连续切片，切片厚度约4 μm，每例选取5张，一张用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）代替一抗，作为阴性对照，其余分别进行苏木精-伊红（HE）染色及免疫组化染色。石蜡切片65℃烤片15 min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5 min，95%乙醇Ⅰ、Ⅱ脱二甲苯各1 min，0.01 mol/L PBS振洗5 min×3次，倒尽PBS；放入3% H2O2中，37℃孵育20 min以灭活内源性过氧化物，PBS振洗5 min×3次，倒尽PBS；热修复抗原，滴加适量正常牛血清封闭液PBS振洗2遍后加封闭液，完全盖住组织片部分，37℃孵育30 min，擦干多余液体，加1∶100的一抗（兔抗人14-3-3σ多克隆抗体），PBS代替一抗作为阴性对照。37℃孵育30 min，4℃冰箱过夜；滴加二抗SP（辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG多聚体）37℃孵育15 min，PBS振洗5 min×3次，倒尽PBS；DAB显色5～15 min，H2O2溶液冲洗终止反应，苏木精轻度复染细胞核

1.4 结果判断标准

ER和PR蛋白定位于细胞核，均呈棕黄色颗粒状。以400倍的高倍镜观察5个视野，每个视野观察计数100个细胞，计数3次。镜下观察：对细胞膜及细胞核出现棕黄色或棕色颗粒的细胞作为阳性细胞进行分析，根据整张切片中阳性细胞占全部细胞的比例定为：（-）阳性细胞数

14-3-3σ蛋白的表达以乳腺导管和小叶上皮细胞浆有棕黄色着色为阳性胞浆。随机选取10个高倍镜视野（200倍），计数1000个细胞，以积分法计算结果，即根据每张切片的染色强度和阳性细胞比例计分。着色强度：无色0分；浅黄色1分；棕黄色2分；棕褐色3分。着色细胞比例：无着色0分；60%为3分。两者相加0～2分为阴性；3～4分为阳性；5～6分为强阳性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验；Pearson系数检测相关性，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 浸润性乳腺癌组织与正常乳腺组织14-3-3σ、ER及PR表达情况的比较

浸润性乳腺癌组织14-3-3σ蛋白及ER阳性表达率明显低于正常乳腺组织，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；浸润性乳腺癌组织PR阳性表达率与正常乳腺组织比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；浸润性乳腺癌组织中，14-3-3σ蛋白阳性表达率明显低于ER、PR，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；正常乳腺组织中，14-3-3σ蛋白、ER及PR阳性表达率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 浸润性乳腺癌患者临床病理特征与14-3-3σ蛋白表达的关系

不同年龄、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移情况的浸润性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白阳性表达率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；不同TNM分期、组织分型、分化程度、ER及PR表达情况的浸润性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表2。

2.3 浸润性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白表达与PR、ER的相关性分析

55例浸润性乳腺癌患者中，ER阳性的32例患者中，14-3-3σ蛋白阳性表达者13例，而23例患者中ER阴性表达的仅2例，Pearson相关性分析发现，14-3-3σ蛋白与ER阳性表达呈正相关（r = 0.3334，P < 0.05），14-3-3σ蛋白与PR无相关性（P > 0.05）。见表3。

3 讨论

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，且患者日渐趋于年轻化。据统计，全球年约有100万例新发乳腺癌患者，每年死亡人数>41万例[7]。早期诊断是提高临床治愈率和降低病死率的关键所在。在采用传统诊断方法判断肿块是否癌变前，致癌基因通常已经发生改变，因此，肿瘤相关基因以及特异性标志物一直是肿瘤早期诊断的研究热点。肿瘤的发生本质上是原癌基因激活和抑癌基因失活，目前对抑癌基因的研究成为肿瘤研究的热点。乳腺癌的发生、发展是一个多因素及多阶段步骤的复杂过程，基因水平研究也一直是乳腺癌研究的热点。1965年，Moore等[8]在动物的脑组织中发现抑癌基因14-3-3σ（也叫HME1），该基因定位于1q35，是负责G2周期检控点的基因家族成员，在细胞周期信号传导途径中起重要作用，负责细胞损伤的修复，它所编码的蛋白几乎在所有真核生物细胞中都有表达，高表达于正常乳腺上皮。然而，研究发现，该基因在人类乳腺癌中经常失活，且在原发性膀胱癌、肠癌、骨巨细胞瘤、食管鳞癌、宫颈癌、肝癌、鼻咽癌中的表达也明显下调或失表达[2-6，9]，是人类乳腺癌中经常失活的重要抑癌基因。Boudreau等[10]研究显示，随着肿瘤的发生、发展，14-3-3σ蛋白表达逐渐下降，表明其在乳腺癌中是一种肿瘤抑制蛋白，可能成为乳腺癌发生、发展事件的监测指标。

乳腺癌是激素依赖性恶性肿瘤，其肿瘤细胞的生长、增殖受体内性激素水平的影响。ER、PR的检测对判断乳腺癌的发展、预后、指导内分泌治疗具有一定的意义，近来研究认为，当乳腺组织癌变时，ER和PR会部分消失或者全部消失[11-14]。研究表明，乳腺癌ER和PR表达阴性者，远处转移率高，骨转移和脑转移发生率也很高，预后差[15]，提示检测ER和PR表达情况对于判断预后很有意义。

目前，国内尚未见关于乳腺癌组织中14-3-3σ蛋白表达与ER、PR的相关性研究，但Wang等[16]研究发现，14-3-3σ在人类子宫平滑肌瘤的下调表明其在肿瘤的发生中发挥着重要作用，其机制可能与上调ER和PR表达有关。本研究选择我院手术切除的浸润性乳腺癌组织标本55例作为研究对象，同时选取同一患者的癌旁>5 cm处乳腺组织，且经病理证实为正常乳腺组织31例，采用免疫组化SP法检测各乳腺组织中14-3-3σ蛋白及ER、PR的表达情况，研究发现，浸润性乳腺癌组织14-3-3σ蛋白、ER阳性表达率均明显低于正常乳腺组织，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），而浸润性乳腺癌组织PR阳性表达率与正常乳腺组织比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；浸润性乳腺癌组织中，14-3-3σ蛋白阳性表达率明显低于ER、PR，差异均有统计学意义（均P < 0.05），这与刘廷等[17]的研究一致。正常乳腺组织中，14-3-3σ蛋白、ER及PR表达情况比较，差异无统计学意义（P > 0.05），提示14-3-3σ蛋白低表达可能在乳腺恶性转化中起着重要作用，且进一步研究发现，不同年龄、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移情况浸润性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白阳性表达率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；不同TNM分期、组织分型、分化程度、PR及ER表达情况的浸润性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（均P < 0.05），提示14-3-3σ蛋白低表达可能与ER、PR的低表达存在某种相关性，Pearson相关性分析发现，14-3-3σ蛋白与ER阳性表达呈正相关（r = 0.3334，P < 0.05），14-3-3σ蛋白与PR无相关性（P > 0.05），提示14-3-3σ蛋白与ER阳性表达呈较弱的相关性。

综上所述，14-3-3σ蛋白可能参与浸润性乳腺癌的发生、发展和转移，同时检测14-3-3σ蛋白可以评估浸润性乳腺癌的发生及预后。14-3-3σ与ER的联合检测可成为乳腺癌患者预后判断的重要指标。

[参考文献]

[1] Agrawal A，Tripathi P，Sahu A，et al. Breast screening revisited [J]. J Family Med Prim Care，2014，3（4）：340-344.

[2] 李颖智，金海鸿，胡惠静，等.应用免疫组织化学法检测14-3-3ε和Peroxiredoxin 1在骨巨细胞瘤中的表达[J].国际免疫学杂志，2014，37（2）：165-168.

[3] 谭锋维，赵亮，邵康，等.食管鳞癌组织中14-3-3ε表达与临床病理因素及预后的相关性[J].中华医学杂志，2011， 91（33）：2305-2309.

[4] 侯艳芳，晁玮霞，齐义军，等.14-3-3σ蛋白与宫颈癌的关系[J].解剖学杂志，2011，34（5）：623-625.

[5] Reis H，Pütter C，Megger DA，et al. A structured proteomic approach identifies 14-3-3Sigma as a novel and reliable protein biomarker in panel based differential diagnostics of liver tumors [J]. Biochim Biophys Acta，2015，1854（6）：641-650.

[6] 王遥易斌.14-3-3σ在鼻咽癌中的研究进展[J].国际肿瘤学杂志，2011，38（6）：435-438.

[7] 冼书林.陆云飞，彪，等.基因芯片技术在乳腺癌诊断和治疗中的应用[J].广西医学，2002，32（20）：2741-2743.

[8] Moore BW，Mcgregor D. Chromatographic and electrophoretic fractionation of soluble proteins of brain and liver [J]. J Biol Chem，1965，240：1647-1653.

[9] Simooka H，Oyama T，Sano T，et al. Immunohistochemical analysis of 14-3-3 sigma and related proteins in hyperplastic and neoplastic breast lesions，with particular reference to early carcinogenesis [J]. Pathol Int，2004，54（8）：595-602.

[10] Boudreau A，Tanner K，Wang D，et al. 14-3-3σ stabilizes a complex of soluble actin and intermediate filament to enable breast tumor invasion [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（41）：E3937-E3944.

[11] 温本，杨志华，郑文滔.乳腺癌放疗期内应用苦参碱血清VEGF变化的临床意义[J].中国实验诊断学，2011， 15（11）：1916-1917.

[12] 王芳，尹芳蕊，华云旗.乳腺癌中ER、PR表达与乳腺癌预后相关性的初步分析[J].内蒙古医学杂志，2008，40（9）：1206-1207.

[13] 李文华，孙奇，覃希，等.ER、PR、C-erbB2、HMFG在乳腺癌组织中的表达及临床意义[J].山东医药，2011，51（47）：54-56.

[14] 凌三莲.VEGF、CA153、CA125和CEA在乳腺癌预后判断中的表达及意义[J].放射免疫学杂志，2009，22（3）：286-288.

[15] 许立生，王水，黄中晶，等.ER、PR、VEGF、CA153、CA125和CEA水平在乳腺癌预后判断中的临床意义[J].实用医学杂志，2012，28（21）：3565-3567.

[16] Wang L，Huang H，Liu D，et al. Evaluation of 14-3-3 protein family levels and associated receptor expression of estrogen and progesterone in human uterine leiomyomas [J]. Gynecol Endocrinol，2012，28（8）：665-668.

[17] 刘廷，齐凤杰，赵树鹏，等.14-3-3σ和Mdm2蛋白在浸润性乳腺癌中的表达及意义[J].广东医学，2012，33（22）：192-195.

（收稿日期：2015-02-15 本文编辑：李亚聪）