缬草不定根组织培养的研究

摘要：为了研究不同培养条件对缬草（Valeriana fauriei var.dasycarpa Hara）不定根生长及其有效成分含量的影响，利用组织培养技术结合高效液相色谱，通过改变培养基蔗糖、氮源和磷源浓度，研究其对缬草不定根的生长和缬草三酯类、缬草烯酸类合成的影响。结果表明，当蔗糖浓度为60 g/L时最适合缬草不定根的生长以及总缬草三酯类和总缬草烯酸类的生产。NO3-/NH4+为1∶1时，不定根生长量和缬草三酯类以及缬草烯酸类达到最高。改变培养基NaH2PO4浓度时，缬草不定根生长均比不添加NaH2PO4时旺盛，但高浓度的NaH2PO4抑制了缬草三酯类和缬草烯酸类的合成，NaH2PO4为基本培养基的0.3倍时，不定根生长量最高，达14.89 g/L，增长率也最高，达到16.18倍，缬草烯酸类也达到最高产量为13.88 mg/L。

关键词：缬草（Valeriana fauriei var.dasycarpa Hara）；生物反应器；缬草烯酸：缬草三酯；蔗糖浓度；氮源；磷源

中图分类号：Q813.1+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）05-1304-03

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.05.055

Study on the Adventitious Roots Tissue Culture of Valeriana fauriei var. dasycarpa Hara

LI Mei-yang， JIN Jiang-shan

（College of Agriculture， Yanbian University， Yanji 133002， Jilin，China）

Abstract：To explore the effects of different culture conditions on Valeriana fauriei var. dasycarpa Hara adventitious roots growth and its effective components synthesis，the adventitious roots were obtained through tissue culture by manipulation of sucrose concentration， nitrogen and phosphate sources and the growth of plant， the content of valepotriates and valerenic acids were determined by HPLC. The results showed that when the sucrose concentration of 60 g/L were favorable for growth of adventitious roots and total valepotriates and valerenic acids production. The maximum root growth rates and content of valepotriates and valerenic acids were achieved while NO3-/NH4+ was 1∶1. To compare the media with adding NaH2PO4 and the medium without adding NaH2PO4，changing of NaH2PO4 concentration could favor for the adventitious root growth. But high NaH2PO4 concentration inhibited valepotriates and valerian acid biosynthesis. When NaH2PO4 in the basic culture medium of 0.3 times， growth of adventitious roots reached a maximum production of 14.89 g/L，growth rate was the highest， reached 16.18 times， total valerenic acids content was up to the highest yield 13.88 mg/L.

Key words：Valeriana fauriei var.dasycarpa Hara；bioreactor；valerenic acid；valepotriate；sucrose concentration；nitrogen sources；phosphate sources

缬草（Valeriana fauriei var.dasycarpa Hara）属于败酱科（Valerianaceae）缬草属（Valeriana）多年生草本植物，该属植物全世界约有250余种，主要分布于气候温和潮湿的地区， 遍布整个欧洲、亚洲北部、南美洲以及美国[1]。中国约有30种（含变种），主要分布于西南、西北及东北地区[2]。缬草在欧洲及美国常被用于治疗轻、重度失眠，具有镇静安神、解挛止痛、抗抑郁和抗肿瘤等作用，一直作为温和的镇静安神催眠药使用，缬草提取物及其制剂在国际上十分畅销，销售额列植物药前10位[3]。缬草的根和地下根茎作为镇静药已有很久的用药历史，中国早在明代李时珍的《本草纲目》中就有记载[4]，国外在Discorides时代也曾用过该药，古希腊人和古罗马人很早就认识到缬草具有镇静安神作用[5]。

缬草属植物自然生长十分缓慢，野生缬草资源急剧下降，同时不易人工栽培，因此采用细胞组织培养技术就显得十分迫切。该技术可以不受季节、环境、气候等影响，可以提供均一产物。国内外学者先后开展了缬草的组织培养研究，但对缬草不定根的培养和合成次生代谢产物的研究报道比较少[6]。本试验主要研究了蔗糖浓度、氮源和磷源对缬草不定根生长及其次生代谢产物缬草三酯类和缬草烯酸类合成的影响，旨在完善缬草离体培养条件，为缬草的工厂化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试种子购自韩国高丽大学种子库，经韩国全南大学黄柏教授鉴定为Valeriana fauriei var.dasycarpa Hara。种子经无菌处理获得无菌苗并在MS+0.2 mg/L NAA培养基中诱导不定根，在B5液体培养基中继代多次。缬草三酯（Valtrate）、乙酰缬草素（Acevaltrate）、异缬草三酯（Isovaltrate）、缬草烯酸（Valerenic acid）、乙酰基缬草烯酸（Acetoxy valerenic acid）、羟基缬草烯酸（Hydroxy valerenic acid）等对照品由荷兰格罗宁根大学的Rein Bos博士提供。

1.2 试验方法

1.2.1 蔗糖浓度对缬草不定根培养的影响 将继代多次的缬草不定根约20 g（FW）接种到3 L气球型气升式生物反应器（含2 L培养基）中培养。培养基添加不同质量浓度的蔗糖（30、40、50、60、70、80、90 g/L）。培养基pH灭菌前调到5.7，所有处理均接种3～4个反应器作为重复。

1.2.2 氮源对缬草不定根培养的影响 将继代多次的缬草不定根约20 g（FW）接种到3 L气球型气升式生物反应器（含2 L培养基）中培养。在含有6%蔗糖的B5培养基中采用KNO3和（NH4）2SO4改变NO3-/NH4+，分别为1∶1、2∶1、4∶1、5∶1。pH同上，所有处理均接种3～4个反应器作为重复。

1.2.3 磷源对缬草不定根培养的影响 将继代多次的缬草不定根约20 g（FW）接种到3 L气球型气升式生物反应器（含2 L培养基）中培养。在含有6%蔗糖的B5培养基中加入NaH2PO4，浓度分别为原B5基本培养基的0、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0、4.0倍。pH同上，所有处理均接种3～4个反应器作为重复。

1.2.4 生物量调查及数据分析 培养4周后，从反应器取出不定根，用自来水冲洗2次后再用去离子水冲洗一次，然后加入液氮后进行真空冷冻干燥1 d， 待不定根完全干燥称重并计算其增长率。

增长率=（收获时干重-接种时干重）/接种时干重×100%

1.2.5 次生代谢产物的分析 精确称取缬草干燥粉1.0 g，加甲醇30 mL，超声提取30 min，离心5 min取上清液后，残留物中再加入15 mL甲醇用同样的方法重复提取，把提取3次后的上清液加到一起，蒸发后加3 mL甲醇定容并经0.2 μm膜过滤，即得到样品溶液。缬草次生代谢产物的分析采用李美阳[7]的方法，用高效液相色谱仪测定缬草烯酸类和缬草三酯类成分。取每份供试品溶液和对照品溶液，分别进样20 μL，按外标法计算含量，取3次测试的平均值。

2 结果与分析

2.1 蔗糖浓度对缬草不定根生长及缬草三酯类和烯酸类合成的影响

不同浓度蔗糖对缬草不定根生长和对缬草烯酸类和三酯类合成的影响如表1所示。由表1可以看出，随着蔗糖浓度的增加，缬草不定根干质量先持续增加，当蔗糖浓度为60 g/L时不定根的生长量达到最大值5.58 g/L，不定根干质量增长率也最高，达到 6.04 倍，其次为添加70 g/L蔗糖时不定根的生长量，达到5.25 g/L，干质量增长率达到5.71倍，然后随着蔗糖浓度的增加缬草不定根生长量逐渐下降。缬草三酯类和缬草烯酸类含量也随着蔗糖浓度的增加而增加，当蔗糖浓度为60 g/L时分别达到最高值10.32、12.86 mg/L。继续增加蔗糖浓度时，不定根生长和缬草烯酸类、缬草三酯类合成受到抑制，蔗糖浓度为90 g/L时均降到最低值。

2.2 氮源对缬草不定根生长及缬草三酯类和烯酸类合成的影响

不同比值的氮源对缬草不定根生长、缬草烯酸类和三酯类合成的影响如表2所示。当NO3-/NH4+比值为1∶1时，缬草不定根生长量为最高，达到5.50 g/L，干质量增长率也最高，达到5.98倍，缬草三酯类和缬草烯酸类含量也达到最高，分别为10.29、11.89 mg/L。随着NO3-/NH4+比值的增加，缬草不定根生长和缬草烯酸类、缬草三酯类合成逐渐下降，当NO3-/NH4+的比值为5∶1时为最低值。

2.3 磷源对缬草不定根生长及对缬草三酯类和烯酸类合成的影响

表3为磷源对缬草不定根生长的影响。随着NaH2PO4浓度的提高，缬草不定根生长先持续增加，当NaH2PO4浓度为基本培养基的0.3倍时，不定根生长量最高，达14.89 g/L，干质量增长率也最高，达到16.18倍，缬草烯酸类含量也达到最高，为13.88 mg/L，而缬草三酯类在NaH2PO4浓度为基本培养基的1.0倍时达最高值10.02 mg/L。当缺乏NaH2PO4时缬草不定根生长缓慢，缬草三酯类和缬草烯酸类含量也最低，当NaH2PO4浓度为基本培养基的1.0倍以上，缬草不定根的生长量又有所增加，但缬草三酯类和缬草烯酸类含量呈逐渐降低趋势。以总缬草三酯类和缬草烯酸类含量来考虑，NaH2PO4浓度为基本培养基的0.3倍为最佳磷源。

3 小结与讨论

3.1 蔗糖

蔗糖是植物体内重要的组成成分，蔗糖在培养基中除了提供碳源和能源之外，还具有调节培养基渗透压的作用。本试验研究发现，适当提高蔗糖浓度有利于提高缬草不定根生长量，也有利于提高总缬草烯酸类和缬草三酯类合成。蔗糖浓度较高（高于70 g/L时），缬草烯酸类和缬草三酯类合成受到了抑制，当蔗糖浓度达到90 g/L时，不定根生长缓慢，这可能与高浓度蔗糖引起的较高渗透压抑制不定根生长有关。这与刘亚军等[8]研究蔗糖对茶树儿茶素生物合成的影响结果一致。

3.2 氮源

培养基中硝态氮和氨态氮对缬草不定根生长和次生代谢产物的合成都有一定的作用。NO3-/NH4+的比值较低时，有利于提高缬草不定根生长量，也有利于提高总缬草烯酸类和缬草三酯类合成。随着NO3-/NH4+比值的增加，缬草不定根生长、缬草烯酸类和缬草三酯类合成反而逐渐下降，当NO3-/NH4+的比值为5∶1时降到最低值。

3.3 磷源

磷源对次生代谢的生物合成起着重要的作用，不同植物的次生代谢产物合成所需要的磷浓度不同。本试验研究表明，在一定范围内加大磷源浓度能促进不定根的生长。过低或过高浓度的磷源抑制了缬草烯酸类和缬草三酯类合成。这与郭肖红等[9]对丹参不定根培养的结果一致。NaH2PO4以基本培养基的0.3倍时，不定根生长量最高，达14.89 g/L，增长率也最高，达到16.18倍，缬草烯酸类含量也达到最高，为13.88 mg/L。

参考文献：

[1] LEATHWOOD P D，CHAUFFARD F，HECK E，et al. Aqueous extract of valerian root（Valeriana Officinalis L.） improves sleep quality in man[J]. Pharmacology Biochemistiy and Behavior，1982，17（1）：65-71.

[2] 黄宝康，郑汉臣，秦路平，等.国产缬草属药用植物资源调查[J].中药材，2004，27（9）：632-634.

[3] 黄仁泉，张 立，杨建丽，等.不同种缬草中缬草三酯和缬草烯酸类成分的HPLC分析和比较[J].中草药，2002，33（11）：1000-1001.

[4] 李时珍.本草纲目（草部）.第14卷[M].北京：人民卫生出版社，1991.

[5] HOUGHTON P J. The biological activity of valerian and related plants[J]. J Ethnopharmacol，1988，22（2）：121-142.

[6] 李美阳.培养条件对缬草不定根生长及次生代谢产物的影响[J].安徽农业科学，2013，41（27）：10956-10957，10959.

[7] 李美阳.HPLC法测定不同采集时期的北缬草中生理活性成分含量[J].安徽农业科学，2013，41（2）：604-605.

[8] 刘亚军，王正荣，孙美莲，等.蔗糖对茶树儿茶素生物合成的影响[J].安徽农业大学学报，2014，41（5）：743-750.

[9] 郭肖红，高文远，李克峰.丹参不定根组织培养的研究（Ⅱ）碳源、氮源和磷源对丹参不定根培养的影响[J].中草药，2007，38（6）：907-911.