骨髓基质干细胞与施万细胞联合移植对周围神经缺损的修复作用

[摘要] 目的 探讨骨髓基质干细胞（BMSCs）与施万细胞（SCs）联合移植对周围神经损伤的修复作用。 方法 雌性SD大鼠48只随机分为A、B、C、D 4组，每组各12只；制作右下肢长10 mm坐骨神经缺损模型后，A组注入全贴壁法培养的BMSCs与差速贴壁结合阿糖胞苷法培养的SCs，B组仅注入BMSCs，C组仅注入SCs，D组注入磷酸盐缓冲液（PBS）作为阴性对照。分别于4、8周观察动物一般状态，测定坐骨神经功能指数（SFI）、神经传导速度（NCV）以及免疫组化检测表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达水平。 结果 4周时，SFI绝对值A组（53.07±5.36）优于B组（62.73±7.63）、C组（67.17±8.06）、D组（77.56±2.79），差异有统计学意义（P < 0.05）；A组损伤侧NCV[（20.38±3.13）m/s]优于B组[（16.54±2.18）m/s]、C组[（17.74±0.93）m/s]、D组[（8.25±1.73）m/s]，差异有统计学意义（P < 0.05）。8周时，SFI值A组（35.43±4.5）优于B组（48.25±3.62）、C组（51.48±3.93）、D组（70.53±5.48），差异有统计学意义（P < 0.05）；A组损伤侧NCV值[（25.67±2.18）m/s]优于B组[（19.69±4.07）m/s]、C组[（21.37±3.17）m/s]、D组[（10.93±1.59）m/s]，差异有统计学意义（P < 0.05）。4、8周时A、B、C组EGF和bFGF表达平均光密度值（AOD）与D组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 BMSCs与SCs联合移植能够促进损伤轴突的再生，恢复神经功能，对周围神经损伤具有明显的修复作用。

[关键词] 骨髓基质干细胞；施万细胞；周围神经损伤；细胞移植；聚乳酸-聚羟基乙酸导管

[中图分类号] R338 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（c）-0090-04

周围神经损伤是显微外科常见疾病之一，常由交通意外、工矿事故等外伤引起[1]，损伤部位往往呈碾压伤、挫裂伤，造成神经较长距离缺损，单纯手术难以缝合[2]。自体神经移植一度成为治疗的金标准[3]，然而存在损伤供体部位功能的缺点，随着组织工程学的研究进展，导管支架材料联合细胞移植已经成为替代神经移植的重要方法[4]。本研究突破传统的单一细胞移植的方法，采用骨髓基质干细胞（BMSCs）与施万细胞（Schwann cells，SCs）联合移植，探讨两种细胞相互作用对神经轴突再生的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

雌性SD大鼠[中国农科院哈尔滨兽医研究所提供，许可证号：SYXK（黑）2006-032] 48只，体重（200±5）g；DMEM/F12细胞培养基（Hyclone公司，美国）；胎牛血清（FBS，Hyclone公司，美国）；青-链双抗（碧云天，中国）；胰蛋白酶（碧云天，中国）；Ⅳ型胶原酶（碧云天，中国）；阿糖胞苷（Ara-C，辉瑞公司，美国）；兔抗鼠单克隆抗体S-100（武汉博士德公司）；FITC标记的羊抗兔IgG（武汉博士德公司）；兔抗鼠碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）单克隆抗体（武汉博士德公司）；兔抗鼠表皮细胞生长因子（EGF）单克隆抗体（武汉博士德公司）；聚乳酸-聚羟基乙酸神经导管（PLGA，山东代罡生物材料公司）；多导电生理记录仪（ASB240U，成都遨生）。

1.2 实验方法

1.2.1 骨髓基质干细胞的分离培养 取SD大鼠10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉后，浸泡于75%酒精中10 min，无菌条件下取出双侧股骨，剪去两端，将骨髓冲到10 mL离心管中。反复吹打至单细胞悬液，1500 r/min离心5 min，弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬。采用全贴壁培养法，将细胞接种于培养瓶中，置于含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养。培养5 d后，对细胞进行换液，弃去瓶中培养液，加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液继续培养。待细胞铺满瓶底80%后传代。

1.2.2 施万细胞的分离培养 取SD大鼠10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉后，无菌条件下取出双侧坐骨神经，在解剖显微镜下剥离神经外膜，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后剪成0.5 mm小段，加入0.25%胰蛋白酶和0.03%Ⅳ型胶原酶，37℃消化30 min。吸取上清加入培养液终止消化。重复消化1次，将所得单细胞悬液移入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中。1500 r/min，离心5 min，弃上清，向离心管中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液5 mL，重悬，移入培养瓶，置于含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养。

1.2.3 施万细胞的纯化与检测 SCs的纯化采用差速贴壁离心与Ara-C抑制相结合方法[5]，每15分钟变换1次培养瓶方向，45 min后取未贴壁细胞移入新瓶。24 h后加入Ara-C培养2 d，胰酶消化后移入新瓶，待细胞铺满瓶底80%后传代。取第2代细胞进行爬片，4%多聚甲醛固定后，加入兔抗鼠S-100单克隆抗体（1∶200），4℃过夜，加入FITC标记的羊抗兔IgG二抗（1∶400），孵育30 min后荧光检测。在100倍显微镜下随机选取10个不同视野，计数阳性细胞与总细胞数，计算SCs细胞纯度，公式为：SCs细胞纯度=S-100阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.2.4 实验动物的分组与模型制备 48只雌性SD大鼠随机分为A、B、C、D 4组，每组各12只：A组为BMSCs与SCs联合移植组；B组为单纯BMSCs移植组；C组为单纯SCs移植组；D组仅加入PBS作为阴性对照组。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉后俯卧位固定于操作台，右下肢常规备皮、消毒，取后外侧肌间隙游离暴露坐骨神经，在坐骨神经中段做一长10 mm神经缺损，PLGA导管连接两侧断端，均插入1 mm，各缝合2针。A组向导管内注入1×105/L浓度的BMSCs和SCs各50 μL；B组注入1×105/L的BMSCs 100 μL；C组注入1×105/L的BMSCs 100 μL；D组注入PBS 100 μL。注射完毕后逐层缝合。

1.3 指标的观察与评定

1.3.1 大体观察 观察术后切口情况，右下肢活动能力、步态变化。于4、8周处死动物后观察损伤神经的修复长度及直径。

1.3.2 坐骨神经功能指数（SFI）的测定 每组术后4、8周分别取6只大鼠，记录双下肢足印2～3对，测量损伤侧足印长度（足跟到足尖距离）（EPL）、正常侧足印长度（NPL）、损伤侧足趾宽度（第1趾到第5趾距离）（ETS）、正常侧足趾宽度（NTS）、损伤侧中间足趾距离（第2趾到第4趾距离）（EITS）、正常侧中间足趾距离（NITS）。根据公式SFI=-38.3（EPL-NPL）/NPL+109.5（ETS-NTS）/NTS+13.3（EITS-NITS）/NITS-8.8，计算SFI值，0～-12代表正常功能，-13～-99代表功能部分恢复，-100代表无功能。

1.3.3 神经传导速度（NCV）的测定 4、8周时，每组取SFI测定完毕的大鼠，麻醉后俯卧位固定于操作台上，暴露双侧坐骨神经，游离PLGA导管两侧神经干，应用多导电生理记录仪测定双侧坐骨神经的传导速度，并进行统计学分析。

1.3.4 碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）的免疫组化检测 NCV测定结束后，对各组大鼠处死，取出双侧坐骨神经，去除导管，石蜡包埋后切片脱蜡，3% H2O2浸泡20 min；加入兔抗大鼠bFGF单克隆抗体和兔抗大鼠EGF单克隆抗体（抗体稀释度1∶200），室温过夜；PBS冲洗后，加入生物素二抗（抗体稀释度1∶400），37℃孵育60 min；PBS冲洗后加入新配制DAB显色。各例随机选取6张切片，每张切片随机选取5个高倍视野，应用Image-ProPlus专业图像分析系统测定平均光密度值（AOD），并进行统计学分析。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 18.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨髓基质干细胞的分离培养

采用全贴壁培养法换液2次后，可去除悬浮的血液细胞，贴壁生长细胞以梭形为主兼有圆形、椭圆形。8 d左右原代细胞聚集呈集落样生长，连续传5代后细胞生长良好，未发生异型性改变。

2.2 施万细胞的培养与检测

坐骨神经提取的细胞经差速贴壁法换瓶后，瓶内可见折光性较好的圆形SCs细胞与胞体较大的成纤维细胞。加入Ara-C后，成纤维细胞基本消失，2 d后SCs开始贴壁生长，发出突起，胞体拉长，呈鱼群样排列。传代后细胞形态未发生改变，经S-100抗体荧光染色后，SCs的纯度为（96.2±2.5）%。

2.3 大体观察

术后各组动物全部存活，B组1只，C组2只大鼠切口出现红肿，其余未见异常。术后全部动物出现右下肢跛行，肌力较正常侧减弱。4周时各组处死6只动物，A组可见坐骨神经已恢复连接，修复部位直径略小于正常；B、C组坐骨神经恢复连接，但修复部位直径明显小于正常；D组仅凭借神经外膜相连。8周时各组处死6只动物，A组可见坐骨神经直径与正常相似且略粗；B、C组的修复效果相似，直径略小于正常；D组修复直径较4周时略增大。

2.4 各组坐骨神经功能指数绝对值比较

术后4周A组SFI绝对值优于B、C、D组，差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C组之间差异无统计学意义（P > 0.05）；D组作为阴性对照，其坐骨神经功能仍有部分恢复。术后8周时A组SFI绝对值优于B、C、D组，差异有统计学意义（P < 0.05）；A、B、C组SFI绝对值均小于同组4周时，差异有统计学意义（P < 0.05）；D组SFI绝对值在2个时间点差异无统计学意义（P > 0.05）。说明细胞移植在损伤4周后仍有修复，而单纯导管修复功能无恢复。见表1、图1。

2.5 神经传导速度测定

各组伤侧NCV均小于正常侧，差异有统计学意义（P < 0.05）；8周时A组损伤侧NCV优于4周时水平，差异有统计学意义（P < 0.05），B、C、D组差异无统计学意义（P > 0.05），说明细胞联合移植对恢复神经传导速度的作用更为持久。4周时A组损伤侧NCV大于B、C、D组，差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C组损伤侧NCV比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；B、C组损伤侧NCV均大于D组，差异有统计学意义（P < 0.05）。8周A组损伤侧NCV大于B、C、D组，差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C组损伤侧NCV比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；B、C组损伤侧NCV均大于D组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.6 免疫组化检测结果

在4、8周时分别对各组标本进行免疫组化检测，测定bFGF和EGF的表达水平。4周时bFGF测量AOD值，A组高于B组，B组高于C组，C组高于D组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；8周时bFGF测量AOD值A、B、C组差异无统计学意义（P > 0.05），但均高于D组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。4周时EGF测量AOD值，A组高于B组，B组高于C组、C组高于D组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；8周时EGF测量AOD值，A、B、C组差异无统计学意义（P > 0.05），但均高于D组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表4。

3 讨论

周围神经损伤发生后如何提高修复神经的功能一直是显微外科面临的难点之一，常见的修复方式包括单纯缝合、自体神经移植、神经导管支架以及干细胞修复等等，单一的方法很难达到满意的效果，给患者的生活带来了极大的困扰[6]。BMSCs作为种子细胞在周围神经修复中都起到了关键作用，而SCs则能够提供丰富的营养因子，促进轴突的再生[7]。目前，体外实验表明，BMSCs与SCs共同培养表现出良好的相容性，并且能互相促进增值、分化[8]，但对二者在体内相互作用的报道较少，因此本研究利用PLGA多孔导管作为支架材料，观察BMSCs与SCs联合植入体内对损伤神经的修复效果。

BMSCs在特定的条件下具有分化为神经干细胞，进而分化为神经细胞的能力。神经干细胞能够分泌多种神经营养因子，减轻损伤所致的炎症反应，维持轴突的稳定性，防止轴索反应的扩大。损伤发生后，损伤远端SCs细胞会发生变性，产生大量的EGF和bFGF等因子，为干细胞的分化提供适宜的微环境[9]，BMSCs植入体内后，会在这种微环境下分化，使营养因子的水平呈现放大反应，加速轴突再生。同时，BMSCs分化的神经元会发出突起，交织成网，介导神经信号的传导。SCs植入体内后，会产生黏层素、Ⅳ型胶原等构成基底膜的主要成分，沿支架内壁形成神经外膜，为轴突再生提供生物支架，弥补体内原有SCs分泌的不足[10]。同时移植的SCs也能够分泌营养因子，加速BMSCs的分化作用[11]。

SFI的结果可以看出，联合移植对大鼠坐骨神经功能的恢复作用更为突出，而单细胞移植则没有差别，说明了BMSCs与SCs的移植修复作用相当，都是为轴突的再生提供了营养的支持[12]。值得注意的是，单纯导管修复大鼠仍有部分功能恢复，说明单纯应用PLGA支架材料对长距离周围神经缺损具有一定的修复作用，其可能机制为PLGA支架限制了自身SCs分泌的营养因子外流，在导管中浓聚，促进了轴突的重连。NCV测定结果与SFI基本一致，但在4周后，联合移植大鼠的NCV仍有提高，而单纯移植则不显著，说明了细胞联合移植的修复作用更为持久，这可能与BMSCs分化产生的神经元传导电活动有关，而单纯BMSCs移植由于缺乏营养因子的支持，分化的神经元比例较少。对所用损伤侧NCV可以看出，无论是那种移植方式，其NCV都不及正常侧的1/2，这也是周围损伤修复效果不理想的体现。对于无BMSCs大鼠，没有分化来源的神经元介导信号传递，仅凭借SCs产生的营养因子不能够满足损伤近端轴突的长距离生长；对于含有BMSCs大鼠，其分化产生的胶质细胞可能会阻碍神经信号的传递，两种原因都可能导致NCV的减慢。

EGF和bFGF是促进轴突生长的重要神经营养因子[13]，研究表明，二者联合作用的效果要明显强于单独应用，且二者联合应用具有诱导BMSCs向神经元分化的作用[14]。本实验检测EGF和bFGF的表达，可见短期内（4周）联合移植组营养因子的表达水平更高，BMSCs所分泌的营养因子水平高于SCs，而在长期（8周）则无明显差别，可能是与随着时间的进展，细胞分化且营养不足有关。但由于条件限制，检测尚存在不足，如果对体内的全部营养因子进行蛋白组学的鉴定，则可全面分析细胞移植对神经再生的影响。

综上所述，BMSCs与SCs联合移植能够促进损伤轴突的再生，恢复神经功能，对周围神经损伤具有明显的修复作用。

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（收稿日期：2013-05-29 本文编辑：李继翔）