谷子胁迫诱导型启动子SiRLK35P的分离及生物信息学分析

摘要：本研究以谷子 “豫谷1号”为材料，结合相关数据库检索，以谷子幼苗提取的基因组DNA为模板，经PCR特异扩增SiRLK35上游1 893 bp调控序列，命名为SiRLK35P。结合PLACE数据库，对SiRLK35P进行生物信息学分析，并对其诱导表达情况进行了预测。结果显示，SiRLK35P中含有ABRELATERD1（ACGT）、GCCCORE（GCCGCC）等多种顺式作用元件，部分元件已知与不同逆境胁迫及应答相关，预测该启动子可能参与谷子胁迫响应，调控下游基因在胁迫等逆境条件下的表达水平，从而对谷子在胁迫下的应答进行调控。该研究为定向改良谷子抗逆特性、培育谷子抗逆新品种提供了候选材料。

关键词：谷子；启动子；SiRLK35P；顺式作用元件；抗逆；品种培育

中图分类号：S515：Q781 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）07-0007-05

Abstract Using Yugu 1 as material， a 1 893 bp upstream regulatory sequence of SiRLK35 gene， which named SiRLK35P， was identified by database searching， and was isolated by PCR amplification using genomic DNA of foxtail millet as template. Bioinformatics analysis of SiRLK35P was carried out with PLACE database， and its expression pattern was forecasted. The results showed that several cis-acting elements， such as ABRELATERD1 （ACGT） and GCCCORE （GCCGCC）， existed in SiRLK35P， and parts of them were known to be associated with stress responsive processes， which indicated that SiRLK35P might participate in stress response and regulate the expression levels of downstream genes under stress conditions. This research would provide a candidate material for stress resistance improvement and new variety breeding of foxtail millet.

Keywords Foxtail millet； Promoter； SiRLK35P； Cis-acting element； Stress resistance； Variety cultivation

启动子是一段位于功能基因上游，能结合RNA聚合酶及其他转录因子，从而决定基因转录起始以及表达量的DNA序列。启动子作为基因上游的调控序列，其中的顺式作用元件在基因的转录及时空表达调控方面发挥重要作用[1]。对基因启动子的研究，尤其对该序列中所包含的不同调控元件的解析，将有助于预测基因的表达调控模式，为进一步解析基因功能奠定基础。

根据启动子所包含的关键调控元件的种类及功能，结合其下游调控基因的生物特性，植物中启动子通常可分为三类：组成型启动子、组织特异性启动子和胁迫诱导型启动子[2]，但同时很多组织特异性启动子和胁迫诱导型启动子也包含组成型启动子[3]。其中，胁迫诱导型启动子可对逆境条件如干旱、高盐等非生物胁迫或病虫害等生物胁迫产生响应，从而对基因的转录及表达进行调控[4]。

谷子在我国北方种植广泛，是我国传统粮食作物兼战略储备作物。但在国际科学界，其遗传学研究相对落后。2012年，谷子测序工作的完成[5]，为解析谷子基因功能及其调控机制提供了新的途径。本项目组在前期研究中发现一个与谷子抗逆相关的类受体蛋白激酶基因SiRLK35[6]。本研究拟结合谷子数据库检索分离得到该基因启动子，并通过启动子区作用元件分析，明确该启动子类型，以期为进一步解析SiRLK35基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究以谷子品种“豫谷1”为材料。pEASY BLUNT试剂盒、TransStart FastPfu DNA Polymerase试剂盒、2×EasyTaq SuperMix均购于Transgen公司（山东济南雨同生物科技有限公司）；薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于GENERAY Biotechnology；高纯质粒小量制备试剂盒购于BioTeke公司（济南承森贸易有限公司）；引物由上海英潍捷基公司合成；其余试剂为进口或国产分析纯。

1.2 基因组DNA提取

将“豫谷1号” 培养3周至三叶期，取其幼苗，使用TPS法提取谷子基因组DNA。

1.3 启动子SiRLK35P的分离

检索国家谷子数据中心（http：///），得到SiRLK35基因起始密码子上游1 893 bp序列，作为基因启动子序列，命名为SiRLK35P。使用Primer Premier 5设计引物SiRLK35PS1：TGCTTGTGCGTCTGCGCCGTGTGA、SiRLK35PA1：AACGGTTTATTTGCTTGGAGTACCT。以谷子幼苗基因组DNA为模板，PCR反应体系为：基因组DNA 1 μL、引物SiRLK35PS1、SiRLK35PA1各0.5 μL、TransStart FastPfu DNA Polymerase 1 μL、5×TransStart FastPfu Buffer 4 μL、dNTPs 2 μL，ddH2O补齐到20 μL。反应程序设置如下：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57.5℃ 30 s，72℃ 2 min，34个循环；72℃ 10 min。

PCR产物经胶回收，与pEASY BLUNT载体连接，转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞，均匀涂布于含100 mg/L Amp抗性的LB平板， 37℃倒置培养过夜，经菌落PCR鉴定，挑取阳性的单克隆，提取质粒后送至山东省农业科学院生物技术研究中心测序室测序。

1.4 启动子SiRLK35P中顺式作用元件分析

利用PLACE数据库（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）对启动子所含的式作用元件进行分析[7]。

2 结果与分析

2.1 启动子SiRLK35P的克隆

借助序列特异性引物，应用PCR扩增到一条大约2 000 bp的条带，测序结果显示条带大小为1 893 bp，与预测片段大小一致（图1）。

2.2 启动子SiRLK35P顺式作用元件分析

使用PLACE数据库，对SiRLK35基因启动子SiRLK35P中所包含的顺式作用元件进行预测。结果如图2，该启动子中除含有组成型的、序列保守的基本调控元件CAAT BOX、TATA BOX及组织特异性的胚乳醇溶蛋白元件DOFCOREZM之外[8，9]，还含有多种与植物抗逆相关的顺式作用元件。其中包括参与植物抗逆以及生长发育调节的W BOX元件5个，调控ABA响应的ABRELATERD1元件3个、DPBFCOREDCDC3元件1个，在调控茉莉酸诱导的基因表达中起重要作用的GCCCORE元件5个，受SA诱导的GT1CONSENSUS元件1个，与致病菌盐诱导相关GT1GMSCAM4元件1个，以及赤霉素响应元件PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A 2个， 与氧化反应相关的CURECORECR元件 6个（表1）。

3 讨论与结论

诱导型启动子是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，可以被外界信号诱导表达，从而启动其对下游基因在转录水平上的调控。诱导型启动子在各物种中都有发现且研究较多，但在谷子中的研究相对较少。rd29A启动子是目前研究最广泛的诱导型启动子之一，杨春霞等[10]通过构建rd29A启动子驱动GUS基因的植物表达载体转化烟草，发现经胁迫处理后，GUS基因表达增强，说明胁迫环境可诱导rd29A启动子活性；Xu等[11]通过构建含有PsPR10启动子的载体转入烟草，结果显示，SA、ABA以及MeJA处理均可诱导其活性；丽等[12]通过对大豆中与衰老相关的类受体蛋白激酶基因rlpk2上游启动子区域研究发现，该启动子能够在番茄愈伤组织生长中瞬时表达； Li等[13]从山葡萄叶片中发现在几丁质酶基因VCH3的上游存在两个SA顺式作用元件，其表达受SA诱导；彭建令等[14]克隆了3个含有细菌诱导元件的启动子PPP1、PPP2、PPP3，转入烟草植株后均可受青枯菌诱导；姜骁等[15]通过构建NTORK1启动子驱动的GUS基因表达载体，瞬时转化烟草叶片，结果NTORK1启动子可被低浓度的NAA和高浓度SA诱导表达。

本研究借助PLACE数据库对启动子SiRLK35P进行分析，结果显示，该区域中含有大量参与胁迫响应、功能行使的顺式作用元件，其中包括参与植物抗逆响应的W BOX，说明该启动子可能对逆境产生响应，从而调控下游基因表达；另外还含有GA响应元件PYRIMIDINEBOXOSRA MY1A，调控ABA响应的ABRELATERD1元件、 DPBFCOREDCDC3元件，在调控茉莉酸诱导的基因表达中起重要作用的GCCCORE元件，受SA诱导的GT1CONSENSUS元件以及与致病菌盐诱导相关GT1GMSCAM4元件，说明该启动子可能受GA、ABA等多种激素诱导并调控下游基因表达。因此，启动子SiRLK35P具有多重因子诱导的活性，其下游基因SiRLK35可能在谷子的胁迫及诱导响应中发挥重要作用。

以上结果显示，启动子SiRLK35P为胁迫诱导型启动子，具有被多种胁迫诱导的活性，推测在植物受到干旱、盐等胁迫时，SiRLK35P可以通过调控下游基因的转录和表达水平，从而使植物对逆境胁迫做出响应，减少胁迫对植物的伤害。目前，该启动子下游调控基因SiRLK35的植物双元表达载体已构建成功，拟借助基因工程技术获得转基因植株，从而对该基因的生物学功能及其在植物抗旱抗逆等方面的应用进行研究。

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