交联青霉素G酰化酶聚集体制备及其催化特性研究

(1.鲁东大学生命科学学院，山东烟台264025：2.山东师范大学信息科学与工程学院，山东济南250014)摘要：目的考察交联青霉素G酰化酶聚集体催化特性，探讨其应用潜力。方法以硫酸铵为沉淀剂获得青霉素G酰化酶蛋白沉淀，戊二醛交联沉淀的蛋白质制备交联酶聚集体，在此基础上研究交联酶聚集体的催化特性。结果交联粪产碱杆菌来源青霉素G酰化酶聚集体的最适反应温度55℃，最适pH 9.0，其酸碱和热稳定性均优于游离酶，重复使用13批次几乎无酶活性丢失，反应20批次后仍有50.9％的活性。结论交联酶聚集体的稳定性较游离酶好，具有一定的工业应用前景。

关键词：青霉素G酰化酶；交联酶聚集体；催化特性；固定化酶

中图分类号：0814.2

文献标识码：A

文章编号：1672-979X(2012)03-0077-05

青霉素酰化酶是半合成抗生素生产中关键酶，可以合成众多青霉素类和头孢菌素类抗生素。该酶在手性合成物拆分与合成方面也有很多应用，如氨基酸拆分、手性醇合成等。但采用游离酶催化反应后难以分离回收，工艺成本较高，故在工业生产中多采用固定化酶形式。酶固定化是拓宽青霉素酰化酶应用范围的重要工序。

自1967年首次将固定化氨基酰化酶用于氨基酸拆分工业以来，载体固定化酶技术(吸附、共价结合、包埋、微囊化等)在随后几十年间取得了很大进步，且在工业生产中有较好地应用。但由于该技术需要载体固定(载体约占固定化酶总量的90 ％,99％)，产生固定化酶“活性稀释”作用，导致低时空产率和低产量。此外，通过载体固定化通常会致使超过50％的活性损失，尤其是酶在高负载量固定过程中。由于缺乏选用固定化酶载体的理论指导，固定化酶载体要依靠实验室大量的重复优化筛选工作，往往消耗大量时间试验，且会出现许多失败的结果。相对载体固定化酶来说，非载体固定化酶技术尤其是交联酶聚集体(cross-linked enzyme aggregate，CLEA)具有良好的催化效能，特别是单位体积的高催化活性和不需昂贵的商业化载体等优点受到广泛关注。本文通过制备交联青霉素G酰化酶聚集体并研究其催化性能，以期为进一步应用奠定良好基础。材料与方法

1.1材料与设备

50％戊二醛(AR，上海晶纯试剂)，青霉素G钾盐和6一氨基青霉烷酸(6一APA，华北制药)；对二甲氨基苯甲醛(PDAB，AR，上海精纯试剂)；其余试剂均为分析纯。粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(Alcaligeties　ecal　penicillin G acylaset PGA)酶液，华东理工大学鲁华生物技术研究所惠赠。

SHA。C水浴恒温振荡器(金坛恒丰)：WFJ，7220型可见分光光度计(尤尼柯)。

1.2交联青霉素G酰化酶聚集体的制备

粪产碱杆菌青霉索G酰化酶酶液经6 000 r／rain离心10 min去除菌体收集上清，按90％饱和度加入硫酸铵。在磁力搅拌器上缓慢搅拌过夜沉淀酶蛋白。

经硫酸铵处理后的酶蛋白沉淀液加入50％戊二醛至终浓度为3％(w／v)，缓慢搅拌12 h充分交联酶蛋白。交联后青霉素G酰化酶经6 000 r／min离心6 min，去上清后重复洗涤离心2次收集交联青霉素G酰化酶聚集体。

1.3酶活性测定――PDAB；：Atul

PDAB显色液与PGA催化青霉素G钾盐生成的6-APA作用，酸性条件下生成的黄色溶液(席夫碱)在415 nm有最大吸收。以0.1 mol／L，pH 7.8的磷酸钾缓冲液为反应介质，以4％(w／v)青霉素G钾盐作底物，于37℃用酶水解5 min，单位酶(mL或g)每分钟水解青霉素G钾盐产生l p,mol 6-APA所需的酶量为1个酶活性单位。

1.4交联青霉素G酰化酶聚集体的结构表征

真空冷冻干燥交联青霉素G酰化酶聚集体，电子显微镜下观察交联青霉素G酰化酶聚集体的表面结构。

1.5交联青霉素G酰化酶聚集体的催化特性

在不同反应体系和反应条件下，分别比较测定交联青霉素G酰化酶聚集体和游离酶的最适反应温度、最适反应pH、热稳定性、酸碱稳定性、批次反应过程和批次稳定性。

2结果与分析

2.1扫描电镜形态观察

在放大250和3 000倍电镜图下可较清楚的看到聚集体的整体形状，交联青霉素G酰化酶聚集体结构紧密，分子间缝隙有利于底物分子和产物的内外扩散，使交联青霉素G酰化酶聚集体保持良好的催化活性。酶蛋白在交联剂的作用下形成不溶性酶聚集体，这种多孔且稳定酶聚集体的结构，使得操作中具有便于回收重利用以及生产能力和稳定性都较高的优点。

2.2不同pHT交联青霉素G酰化酶聚集体与游离青霉素G酰化酶催化活性比较

游离青霉素G酰化酶最适pH值为10，交联青霉素G酰化酶聚集体最适pH值是9。游离青霉素G酰化酶与交联青霉素G酰化酶聚集体在低pH下相对活性差别较小，两者均随pH升高而增大。然而当pH>10时，游离青霉素G酰化酶的催化活性迅速降低，交联青霉素G酰化酶聚集体的降低幅度则较小。如在pH 11时，交联青霉素G酰化酶聚集体仍然保持着68.8％的相对活性，游离青霉素G酰化酶的相对活性则只有39.7％。因此，交联青霉素G酰化酶聚集体比游离青霉素G酰化酶有更高的酸碱适应性。2.3不同温度下交联青霉素G酰化酶聚集体与游离青霉素G酰化酶活性比较

随着测活温度升高，游离青霉素G酰化酶与交联青霉素G酰化酶聚集体活性逐渐增大，55℃时两者均达到最大酶活性。温度>55℃时，游离青霉素G酰化酶的活性迅速降低，交联青霉素G酰化酶聚集体的相对活性则变化较小。如70℃时，交联青霉素G酰化酶聚集体仍保持60％以上的相对活性，而游离青霉素G酰化酶则只有20％的相对活性。固定化后酶分子结构刚性增强，抗拒热变作用能力提高，因此CLEA比游离酶有更高的温度适应性。

2.4不同pH下交联青霉素G酰化酶聚集体与游离青霉素G酰化酶稳定性比较

交联青霉素G酰化酶聚集体和游离青霉素G酰化酶在不同pH的反应体系中保存12 h后，在pH 8体系中测定酶活性。交联青霉素G酰化酶聚集体在pH 10保存稳定性最好，游离青霉素G酰化酶活性则在pH 7时稳定性最好。游离青霉素G酰化酶在pH9时相对活性为45％，到pH 10时只有13％。与游离青霉素G酰化酶相比，交联青霉素G酰化酶聚集体在pH较高时稳定性较好，pH 10时相对活性达到最大，在pH 11下聚集体仍然保持着70％以上的活性。因此，交联青霉素G酰化酶聚集体比游离青霉素G酰化酶具有更高的pH稳定性。

2.5不同温度下交联青霉素G酰化酶聚集体与游离青霉素G酰化酶稳定性比较

将游离青霉素G酰化酶与交联青霉素G酰化酶聚集体分别置于不同温度下保温12 h后，加4％(w／v)

青霉素G钾盐底物反应，结果见图5。在20～50℃范围内，交联青霉素G酰化酶聚集体和游离青霉素G酰化酶都保持较稳定的活性，且在45℃时活性最高。温度超过45℃时，旃离青霉秉G酰化酶迅远失活，趸联青霉素G酰化酶聚集体则仍保持着较高的活性，且在70℃保存12 h后仍有接近50％的相对活性。因此交联青霉素G酰化酶聚集体与游离青霉素G酰化酶比较，温度稳定性更好，能够适应相对高温且长时间的反应过程。

2.6交联青霉素G酰化酶聚集体批次催化反应过程

0.1 g交联青霉素G酰化酶聚集体与4 mL青霉素G钾盐底物溶液(4％，w／v)混合，在45℃，pH 9，0条件下，每隔30 min取样测定活性，结果见图6。在反应1.5 h时酶相对活性最高，随着时间延长，酶活性逐渐降低。主要是因反应时间延长，产物6-APA和苯乙酸增加，非竞争性或竞争性地抑制了酶活性。因此，在45℃，pH 9.0条件下，以水解4％青霉素G钾盐反应1.5 h为一个反应批次。

2.7交联青霉素G酰化酶聚集体批次反应稳定性

在45℃，pH 9.0条件下，以水解4％青霉素G钾盐反应1.5 h为一个批次，交联青霉素G酰化酶聚集体的批次稳定性。聚集体批次稳定性较好，连续反应13批次基本没有酶活丢失，反应20批次后仍有50.9％的酶活性。戊二醛为双功能交联剂，可以与酶分子的氨基发生加成反应形成席夫碱，使其批次反应稳定性提高且重复使用次数增加，具有一定的工业应用前景。 3讨论

cLEA是继交联酶晶体后发展起来的一种无载体固定化酶新技术，其固定化策略是先将酶物理沉淀形成固体颗粒，然后用交联剂交联形成不溶性固态酶颗粒。与其他类型的非载体固定化技术相比，其不需要交联酶晶体固定化前期昂贵的酶纯化过程；克服了交联游离酶的胶状难成形缺陷；固定化后酶活性远高于交联酶喷雾干燥粉末等优点。因此，自上世纪末首次发现后就受到酶制剂研究者的广泛关注，该技术的发现为从理论和实践上设计耐用、高活性、高稳定性和高选择性的固定化酶开辟了全新领域，被认为是最有希望能够取代载体固定化酶的新技术。

本文采用90％硫酸铵为沉淀剂，3％戊二醛为交联剂制备青霉素G酰化酶聚集体，并研究了其催化特性。交联青霉素G酰化酶聚集体最适反应DH 9.0，最佳反应温度为55℃，在相对高温和高pH条件下反应稳定性均优于游离青霉素G酰化酶。交联青霉素G酰化酶聚集体的批次重复利用稳定性也较好，连续反应13批次酶活基本没有丢失，具有一定的工业应用前景。交联酶青霉素G酰化酶聚集体的研究仍有待深入，例如控制酶聚集体粒径大小以减少扩散障碍，如何通过酶聚集体的制备条件选择来调节酶的活性和选择性等，相关研究正在进行中。

参考文献

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