高渗盐溶液对肠缺血 再灌注兔肠屏障功能 保护作用研究

【摘要】目的 研究高渗盐溶液对肠缺血再灌注兔肠屏障功能的保护作用及其机制。

方法 新西兰白兔随机（随机数字法）分为5组，每组18只：正常对照组、缺血再灌注组（IIR）、生理盐水治疗组（NS）、4%高渗氯化钠溶液（4%HS）治疗组、7.5%高渗氯化钠溶液（7.5%HS）治疗组。实验组采用完全夹闭肠系膜上动脉（SMA）1 h，开放再灌注的方法制备肠缺血再灌注模型。3个治疗组均在SMA开放前5 min输注相应质量分数的氯化钠溶液。选择缺血前与再灌注后2、4、6 h 4个时间点取血测定LPS、DLac水平。再灌注6 h每组抽取8只动物处死，取其小肠测定组织中的MPO、MDA、SOD浓度，光镜下对病理形态进行观察，TUNEL法检测肠上皮细胞凋亡。

结果 （1） 各缺血再灌注组再灌注后肠屏障指标LPS、 DLac均显著升高；再灌注6 h肠MDA、MPO、Chiu氏病理评分及肠黏膜凋亡指数（AI）均显著升高（P

结论 高渗氯化钠溶液治疗对肠缺血再灌注损伤具有保护作用，一定的范围内随着盐质量分数的增加而效应增强。

【关键词】缺血再灌注；高渗盐溶液；肠屏障

The protective effect of hypertonic saline solution on intestinal barrier function in the rabbit intestinal ischemiareperfusion models XU Jun*，LIANG Lu，ZHENG Liangliang，LIU Yecheng，XU Tengda，ZHU Huadong，WANG Zhong，YU Xuezhong，MA Sui.*Department of Emergency Medicine， Peking Union Medical College Hospital， Beijing 100730， China

Corresponding author： YU Xuezhong， Email： .cn

【Abstract】Objective To study the protective effect and mechanism of hypertonic saline solution on intestinal barrier function in rabbits intestinal ischemia reperfusion models.Methods Rabbits were randomly（random number） divided into five groups （n=18）： control group， intestinal ischemia reperfusion （IIR） group， normal saline group （NS）， 4% hypertonic saline （4%HS） group， and 7.5% hypertonic saline （7.5%HS） group. The intestinal ischemia reperfusion models were produced by clamping super mesenteric artery （SMA） for 1 hour and declamping SMA for 6 hours. The corresponding sodium chloride solution was infused in the 3 treatment groups in 5 mins before declamping SMA. Before intestinal ischemiareperfusion and 2，4，6 hours after，levels of LPS， DLac in plasma were measured； 6 hours after intestinal ischemia reperfusion，8 rabbits per group were killed to measure levels of MPO， MDA， SOD in intestinal tissues. Meanwhile intestinal morphological changes and intestinal apoptosis were observed.Results LPS and DLac were significantly increased after ischemia reperfusion （P

【Key words】Intestine ischemia reperfusion； Hypertonic saline solution； Intestinal barrier function

人体是一个有机整体，机体的各种脏器功能间存在着关联，一个脏器的疾病和功能损害常通过解剖、炎症介质等关联机制波及其他脏器的功能。然而当机体处于疾病状态下，作为应激反应的一部分，肠道供血减少，屏障不同程度破坏。细菌及毒素越过肠黏膜屏障侵入正常情况下是无菌环境的肠外组织，如门静脉以及其他远隔器官，这一过程称为肠道细菌毒素移位，其结果势将触发SIRS甚至MODS[1]。因此人们认为肠道不仅是MODS的靶器官，更是MODS的启动者[2-3]。肠黏膜屏障改变的最主要的原因为肠缺血再灌注（intestine ischemia reperfusion，IIR）损伤，因此肠缺血再灌注损伤的保护治疗显得尤为重要，一直以来是急诊及危重病学研究的热点。近年来高渗氯化钠溶液在失血性休克中进行了广泛研究，发现高渗氯化钠溶液不仅能恢复血流动力学[4]，还有非特异性的免疫调节作用[5-6]，能减轻缺血再灌注损伤，本研究旨在探讨高渗氯化钠溶液对肠缺血再灌注肠屏障的保护作用及其可能的保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新西兰大白兔90只，雌雄不拘，体质量2.7～3.5 kg ，（2.9±0.7） kg。由北京协和医院动物实验中心提供。

1.2 实验分组

采用随机数字表法将实验动物分为5组（每组n=18），分别为正常对照组、缺血再灌注对照组（IIR）、生理盐水治疗组（NS，6 ml/kg）、4%高渗氯化钠溶液治疗组（4%HS，6 ml/kg）、7.5%高渗盐溶液治疗组（7.5%HS，6 ml/kg）。正常对照组仅进行假手术处理。所有治疗组均在开放肠系膜上动脉前5 min内输注完相应质量分数的氯化钠溶液。

1.3 动物模型的建立

实验前称质量后，给予兔3%戊巴比妥（美国Sigma公司）30 mg/kg肌肉注射麻醉。2%利多卡因局部麻醉，腹部正中切口，游离出肠系膜上动脉（SMA），使用无创伤动脉夹夹闭SMA阻断血流。1 h后经原路径打开腹腔，取出血管夹，开放SMA，此时认为IIR模型建立。

1.4 监测时间点

共选择4个监测时点：夹闭SMA动脉前基础状态（T0）、再灌注后2 h（T2）、再灌注后4 h（T4）、再灌注后6 h（T6），自颈内静脉抽取静脉血3 ml，3500 r/min 离心15 min，分离血浆，-70℃保存。再灌注6 h后每组抽取8只兔处死，并留取小肠组织标本测定肠组织中的MDA、SOD和MPO。

1.5 监测指标

1.5.1 血浆DLac测定 采用Brandt等[7]方法测定，波长340 nm，测定吸光度，作标准曲线，计算DLac浓度。

1.5.2 血浆LPS测定 采用终点法测定LPS， 波长405 nm，作标准曲线，计算LPS浓度。Pyrochrome试剂盒（鲎试剂盒），购自Associates of Cape Cod公司。

1.5.3 肠组织MDA、SOD、MPO测定 取肠组织0.5 g制备成10%肠组织组织匀浆，待做MDA、SOD、MPO测定。MDA测定采用硫代巴比妥酸显色法，SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法，试剂盒均购置南京建成生物工程研究所；MPO测定采用双抗夹心ELISA法，试剂盒购自RB公司。

1.5.4 小肠病理评价 常规HE染色，根据Chiu氏六级评分评价肠黏膜损伤程度[8]。

1.5.5 肠黏膜凋亡测定 TUNEL 试剂盒由Roche公司生产。计数每100个上皮细胞中凋亡细胞个数，即凋亡指数（apoptotic index， AI） ，每张切片各任选5个视野，求其平均值。

1.6 统计学方法

统计学分析采用SPSS 15.0统计软件。结果应用均数±标准差（x±s）表示。同一组内不同时间点之间的指标比较采用方差分析LSDt检验，组间比较采用Tukey法，以P

2 结果

2.1 肠屏障通透性指标DLac与LPS改变

DLac与LPS反映肠黏膜损害程度和通透性变化指标。表1显示正常对照组血液中DLac与LPS在整个过程中差异无统计学意义（P>0.05）。而所有SMA阻断组于再灌注2 h时，DLac与LPS浓度较基础状态升高，差异具有统计学意义（P0.05）；4%HS组DLac与LPS水平低于IIR组、NS组，且差异具有统计学意义（P

2.2 再灌注6 h肠组织中SOD、MDA及MPO改变

所有SMA阻断再灌注后肠组织中MDA与MPO均出现显著上升，与正常对照组比较差异具有统计学意义（P0.05）；4%HS组MDA和MPO水平低于IIR组与NS组两组，且差异具有统计学意义（P

2.3 病理光镜与凋亡指数改变

IIR组光镜下肠病理损伤显著，Chiu氏评分为（4.36±0.52）分，与正常对照组差异具有统计学意义（P0.05）。而用高渗盐溶液治疗却能够明显减轻IIR所致的小肠黏膜损伤，4%HS组黏膜损伤Chiu氏评分为（2.69±0.43）分，明显轻于IIR组（P

表3可见，通过TUNEL法肠黏膜细胞原位凋亡检测，对各组肠黏膜上皮细胞凋亡的观察发现， IIR组AI为（11.6±1.8）与正常对照组差异具有统计学意义（P0.05）；而使用高渗盐水治疗的4%HS组与7.5%HS组两组的AI与IIR组相比出现显著升高，且差异具有统计学意义（P

3 讨论

肠缺血再灌注是严重创伤、烧伤、休克等急性疾病应激状态下发生的一个共同病理生理阶段，可引起许多严重的并发症，是多器官功能障碍综合征发生、发展的重要原因之一[9]。本实验中观察到，小肠缺血再灌注2 h后，反映肠道屏障功能的DLac、LPS显著升高，再灌注6 h肠道病理表现为肠黏膜绒毛破损、塌陷，固有层的细胞成分增多，小肠黏膜血管扩张、充血，部分肠黏膜固有层破坏和溃疡，这提示IIR可引起肠屏障严重受损。本研究还发现再灌注肠组织中脂质过氧化程度MDA出现显著升高，而具有抗氧化作用的SOD出现下降，故再灌注后在肠道产生大量的氧自由基而抗氧化能力减弱是导致IIR损伤主要机制之一；此外，从本研究中还发现缺血再灌注后，反映中性粒细胞浸润程度的MPO出现显著升高。可见，肠缺血再灌注损伤是多种机制参与，而非某一单一机制所致，对其进行干预治疗难以用某一特异性治疗来实现。

对HS的早期研究主要集中恢复失血性休克的血流动力学[4]，后来发现其还有非特异性的免疫调节作用。本研究中发现使用HS治疗，其无论在肠道的病理损伤程度还是在肠的通透性，均明显优于IIR组和等渗盐溶液治疗组，这显示HS能有效的减轻IIR损伤，对再灌注损伤起到保护作用。高渗治疗对IIR的可能的保护机制有：① HS减少IIR后氧自由基的产生，增加肠道抗氧化能力。在本研究中发现在IIR后反映机体内脂质过氧化程度MDA含量出现显著升高，而具有抗氧化作用的SOD出现下降，故再灌注后在肠道产生大量的氧自由基而抗氧化能力减弱是导致IIR损伤主要机制之一。而在使用4%和7.5%HS预处理两组之间肠道组织中MDA较IIR组出现显著下降，而SOD增加。研究发现HS可以诱导应激蛋白血红素加氧酶1（HO1）表达增加，HO1对病理条件下组织氧化损伤起着保护作用[10]。② HS减少中性粒细胞对IIR肠的损伤。IIR后激发IIR局部的炎症反应势必导致大量的中性粒细胞浸润进入IIR肠组织中。从本研究中可以看出在使用HS治疗的两组中，反映中性粒细胞浸润程度的MPO出现不同程度的下降。HS主要通过减少PMN表面黏附分子的表达[11]，减少ICAMl的合成，从而减少PMN在血管内皮表面黏附与锚定[12]。此外HS还抑制中性粒细胞氧化爆发。③ HS通过凋亡途径而非坏死途径来清除IIR后功能异常肠上皮细胞[13]。IIR后势必导致大量的肠上皮细胞功能异常，肠黏膜坏死脱落。本实验中发现采用HS治疗后肠道光镜病理损伤明显减轻，然而使用HS治疗组凋亡显著增加，这提示HS对IIR肠屏障功能的保护是通过凋亡途径来实现。凋亡与坏死最大的区别就是凋亡不会再激发局部的炎症反应，而坏死则将引起强烈的炎症反应。

本研究中虽然发现4%和7.5%HS均能减轻肠缺血再灌注损伤，但这两组之间比较差异具有统计学意义， 7.5%HS效果显著优于4%HS，这提示高渗治疗在缺血再灌注损伤保护作用中存在一定的量效关系，HS质量分数越高，其保护作用越为明显。Murao等[14]用4 ml/kg 体质量和6 ml/kg体质量7.5%HS复苏失血性大鼠， 发现肺损伤与Na+浓度负相关，他们认为， HS的保护效应可能是Na+浓度的作用。亦有体外试验发现，炎性细胞在高渗环境中培养，将会减少炎性细胞因子。如TNFα分泌，抗炎因子IL10则会增加，且呈现出剂量依赖关系，即随着渗透压的增加促炎性细胞因子分泌越少，抗炎因子越多。但这种剂量依赖关系是有一定区间的，如渗透压浓度过高，将会导致促炎性细胞因子分泌出现显著增加。虽然本研究结果也提示HS对脏器功能的保护作用存在着一定的量效关系，但并不是意味着这种量效关系是无条件限制的。Gonzalez等[15-16]分别采用7.5%HS和10%HS对IIR模型进行预处理研究发现，当盐溶液由7.5%升高到10%时其对IIR损伤并未随使用盐溶液的质量分数升高对IIR损伤的保护加强，反而出现下降。这提示使用HS对脏器功能的保护，但有一定的剂量范围，过高质量分数的HS反而会导致脏器的功能保护作用下降。

综上所述， HS对IIR的保护作用具有一定的量效关系，在一定范围内高渗盐溶液质量分数的越高，其对IIR保护作用越强。但目前临床上使用何种剂量、何种质量分数的高渗盐溶液能对脏器起到最佳保护作用尚无系统研究，亦是今后HS对脏器功能保护的研究方向。

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