左归降糖益肾方对2型糖尿病肾病小鼠足细胞nephrin与podocin表达的影响

摘要：目的 观察左归降糖益肾方对MKR转基因2型糖尿病肾病（DN）小鼠足细胞nephrin、podocin表达的影响，探讨其作用机制。方法 8周龄MKR小鼠40只随机分为4组，空白组（A组）、DN组（B组）、DN+中药组（C组）、DN+糖适平+贝那普利组（D组）。B、C、D组给予高脂饮食联合右侧肾切除造模。手术4周后，各给药组给予相应药物，4周后处死小鼠。电化学法观察小鼠空腹血糖，全自动生化仪检测血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）， ELISA法测定尿微量白蛋白（UmAlb），RT-PCR法检测nephrin、podocin mRNA表达，Western Blotting法测定nephrin、podocin蛋白表达，电镜观测足细胞形态结构。结果 与A组比较，B组小鼠空腹血糖、SCr、BUN及UmAlb均明显升高（P

关键词：糖尿病肾病；左归降糖益肾方；足细胞；nephrin；podocin；MKR小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.03.016

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）03-0053-05

糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，肾小球足细胞是DN发生发展的关键细胞，nephrin、podocin作为足细胞裂孔隔膜的主要成分，维持着足细胞的正常形态和功能，其基因和（或）蛋白表达的异常在蛋白尿的发生机制中有着相当重要的作用。左归降糖益肾方由明代医家张景岳的左归丸化裁而来，具有滋阴益气、解毒活血之功效。本课题组前期研究发现，左归降糖益肾方可能通过降低空腹血糖，改善糖耐量、抑制炎症因子的产生和氧化应激作用，解除高血糖对肾小球的刺激，阻断炎症诱导的损伤而达到减少蛋白尿、改善糖尿病早期肾脏损伤的目的[1]。本实验在前期研究的基础上，以高脂喂养并行单侧肾切除的MKR糖尿病肾病小鼠为研究对象，观察左归降糖益肾方对DN小鼠足细胞结构及功能的影响，并探讨其部分机制，为该方进一步应用于临床提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

MKR转基因2型糖尿病小鼠（骨骼肌特异性Insulin/IGF-1双受体缺失的转基因小鼠），美国国立卫生研究院糖尿病研究中心Dr.D.LeRoith提供。MKR小鼠（纯合子），经自然繁殖后用于实验观察。MKR鼠饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心，饲养笼具、垫料、饲料、饮水均按SPF级实验动物的要求进行制备与消毒。

1.2 药物与饲料

左归降糖益肾方由熟地黄、山萸肉、黄芪、丹参等药物组成，原药材购自湖南中医药大学第一附属医院药房，经鉴定为正品，药物经水煎2次，合并煎液，浓缩为1.25 g原药材/mL，经灭菌后置于冰箱4 ℃保存备用。糖适平，30 g/片，北京双鹤药业有限责任公司生产，批号1120337；贝那普利，5 mg/片，深圳信立泰药业股份有限公司生产，批号20120901。高脂饲料由普通饲料加猪油15%、胆固醇1%组成。

1.3 主要试剂

末端全血葡萄糖试剂条（美国强生公司，批号342089）；尿微量白蛋白酶联免疫法（ELISA）试剂盒（ADL公司，lot：201302）；总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，批号K9802）；RT-PCR试剂盒（Fermentas公司，批号K1621）；引物合成（上海生工生物工程技术服务有限公司）；通用型SABC试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号12122A10），DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号K13522E），nephrin、podocin鼠抗兔单克隆抗体（博奥森生物技术有限公司）。

1.4 主要仪器

强生稳豪倍易血糖测试仪（美国强生公司），奥地利产酶标仪，日产HT7700型透射电镜，日立7150全自动生化分析仪（日本），SANYO-80 ℃冰箱，Leica石蜡切片机，Bio-Rad mini型垂直电泳仪及半干转膜系统，Ultrospec 4300紫外可见光分光度计。

2 实验方法

2.1 造模、分组与给药

选取8周龄经遗传鉴定[2]的MKR小鼠40只，按照空腹血糖和体质量分层，随机分为4组，A组为空白组、B组为DN组、C组为DN+中药组、D组为DN+糖适平+贝那普利组。A组以普通饲料喂养，其他组小鼠均于术前1周开始以高脂饲料喂养。参考文献[3]方法，B、C、D组行右侧肾切除。小鼠以10%的水合氯醛（0.04 mL/10 g）腹腔注射麻醉，背部右侧肾区剪毛消毒后，做1 cm左右纵形切口，逐层暴露并分离出右侧肾脏，止血钳夹住肾蒂，结扎肾蒂后切除右肾，并称重。3-0缝合线间断缝合各层以关闭腹腔，连续缝合皮肤，并用青霉素粉外敷抗感染，注意保温，待动物清醒后放入单笼饲养。手术4周后开始给药，药物剂量换算参照剂量-体表面积换算法，每日15：00-16：00灌胃1次。C组以左归降糖益肾方25.76 g原药材/kg灌胃（临床中剂量）；D组以糖适平和贝那普利灌胃，糖适平剂量为9.09 mg/kg，贝那普利剂量为3.04 mg/kg （临床等效剂量）。灌胃容量为0.4 mL/20 g，连续给药4周。

2.2 生化指标检测

①空腹血糖：灌胃前1 d、灌胃4周后，禁食不禁水5 h后，尾静脉采血电化学法血糖仪检测。②尿微量白蛋白（UmAlb）：灌胃前1 d、灌胃4周后，将小鼠放入代谢笼中，禁食不禁水，留取随机尿，采用ELISA法检测，具体操作严格按试剂盒说明进行。③血肌酐（SCr）及血尿素氮（BUN）检测：灌胃4周后，心脏采血，分离血清，采用全自动生化分析仪检测。

2.3 肾组织透射电镜观察

取左肾脏皮髓交界处皮质1 mm3大小的肾组织，固定于2.5%戊二醛中，用于透射电镜检测并拍片。

2.4 RT-PCR法检测小鼠肾皮质nephrin与podocin mRNA表达

取各组小鼠新鲜肾皮质，用动物组织总RNA提取试剂盒抽提其总RNA，采用紫外分光光度计测定其浓度。取1 ?g总RNA，随后用反转录试剂盒以Oligo（dT）为引物进行逆转录反应。β-actin （500 bp）引物：上游5'-TCAGAAGGACTCCTATGTGG-3'，下游5'-TCTCTT TGATGTCACGCACG-3'。nephrin（211 bp）引物：上游5'-CCCAACACTGGAAGAGGTGT-3'，下游5'-CTGGTCGTA GATTCCCCTTG-3'。podocin（193 bp）引物：上游5'-TGAGGATGGCGGCTGAGAT-3'，下游：5'-GGTTTGGAG GAACTTGGGT-3'。β-actin PCR条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，退火58 ℃、30 s，72 ℃延伸30 s，共28循环；最后72 ℃延伸10 min。nephrin、podocin条件：先行95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，退火nephrin 58 ℃、15 s，podocin 64 ℃、12 s，72 ℃延伸30 s，共35循环；最后72 ℃延伸10 min。取PCR产物10 μL于2%琼脂糖凝胶上电泳，用GIS-1000数码凝胶图像处理系统中PCR定量分析得出PCR产物的光密度值，同时以β-actin为内参照，以目的基因与β-actin光密度的比值表示目的基因mRNA的表达水平。

2.5 Western Blotting法检测小鼠肾皮质nephrin、podocin蛋白表达

按试剂盒操作抽取总蛋白，取出已变性的蛋白样品。每孔加40 μg蛋白样品电泳，积层胶电压80 V，分离胶电压120 V。电泳结束后转膜70 min，将转有蛋白的膜置于5%BSA封闭，37 ℃ 1 h，置于一抗（nephrin、podocin一抗分别用封闭液1∶500、1∶400稀释，GAPDH内参按照1∶800稀释）中孵育2 h， PBST洗4次，每次10 min，加入2抗，室温孵育1 h，PBST洗4次。将膜风干，贴在玻璃纸上，加底物，做化学发光，得到胶片。将背景较高的底片放入PIERCE公司X光片背景去除液中，观察到理想的结果时终止反应，用水清洗以去除不需要的背景。GAPDH蛋白为内参，以目的条带灰度值与同个样品的GAPDH灰度值的比值表示目的基因蛋白表达水平。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据用―x±s表示，组间比较采用方差分析，方差不齐采用非参数检验。P

4 结果

4.1 各组小鼠肾皮质病理变化

电镜结果显示，A组足细胞结构完整，足突排列整齐。与A组比较，B组内皮细胞损伤，基底膜增厚，足细胞足突间隙增宽、融合，足细胞脱落，细胞密度、数目减少。C组、D组以上病理变化明显改善。见图1。