植物雌激素抗肿瘤分析

摘要:目的观察染料木素的体外抗肿瘤作用。方法采用溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑(3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)检测法测定染料木素对子宫内膜腺癌细胞系(JEC)、人肝癌SMMC-7721细胞系体外增殖的影响,按台盼蓝排染法计数活细胞,绘制细胞生长曲线。结果MTT法检测显示,染料木素对JEC细胞和SMMC-7721细胞增殖的抑制作用呈现剂量和时间依赖性;随染料木素浓度的升高,JEC和SMMC-7721细胞的生长曲线逐渐下移,10-4 mol•L-1的染料木素作用下的JEC细胞生长曲线呈现与5Fu相似的下降趋势。结论染料木素具有一定的抗肿瘤作用。

关键词:植物雌激素;抗肿瘤;作用

中图分类号:R246.5 文献标识码:A文章编号:1007-9599 (2010) 01-0000-01

肿瘤是危害人类健康的最严重的疾病之一,其发病率呈逐年上升的趋势。植物雌激素又名染料木素,原料药系从豆科植物槐角Sophora japonica L.的干燥成熟果实中提取的异黄酮单体成分,是具有弱雌激素样作用又非雌激素类化合物。流行病学调查、动物实验以及体内、体外的研究显示,染料木素具有防治癌症作用。我们就染料木素抗子宫内膜腺癌细胞(JEC)和人肝癌SMMC-7721作用进行了初步探讨。

一、材料与方法

1.MTT检测法

1)肿瘤细胞的传代培养子宫内膜腺癌(JEC,遵义医学院微生物学教研室吴中明教授提供)、人肝癌SMMC7721(中科院上海生命研究院)用含10%小牛血清的RPMI-1640 (Lot #1165062, GIBCO)培养液稀释成1×105•ml-1的细胞悬液,每个培养瓶2ml,置37℃、5%CO2环境中进行体外培养,待瘤细胞在培养瓶底长至约80%细胞融合时,分瓶传代培养。

2)分组实验分为空白对照组(NS)、阳性对照组(5-fliorouracil,5Fu,10-4mol•L-1。上海旭东海普药业有限公司,批号:031001),5个10倍梯度的试药组(10-4～10-8 mol•L-1的染料木素,95%,陕西赛德高科生物股份有限公司)和与10-4 mol•L-1的染料木素相对应的溶媒对照组(含0.5%乙醇的NS)。

3)操作用RPMI-1640完全培养液分别将肿瘤细胞稀释配制成5×104•ml-1的细胞悬液,接种于96孔培养板,每孔100μl,置37℃,5%的CO2环境中,进行体外培养,24h后加药,每孔10μl,设5个平行孔,空白对照组加入等量生理盐水;结束培养(24,48,72,96h)前4h,每孔加入5mg•ml-1的MTT溶液10μl,结束培养后小心吸弃上清液,每孔加入DMSO 150μl,待甲N完全溶解后于酶标仪(Sunrise,Australia)570 nm处读出各孔的OD值。实验重复3次。

4)评价指标评价指标为平均细胞抑制率(IR)。细胞抑制率(%)=(1一实验孔OD值/对照孔OD值)×100%。IR>50%为敏感,在30%～50%为低度敏感,小于30%为不敏感。

2.台盼蓝排染法及生长曲线的绘制将对数生长期细胞制成浓度为5×104•ml-1细胞悬液,接种于24孔板,每孔1ml。置37℃,5%的CO2环境中培养24h,再行无血清培养48h。更换完全培养基,每孔加入药物100μl(空白对照组加等体积的生理盐水),每组各时间点均设2个平行孔。分别于药物作用1～7d,消化收集细胞,按台盼蓝排染法,用血细胞计数板在光镜下计数活细胞数。以时间为横坐标,活细胞数为纵坐标,绘制细胞生长曲线。

3.统计学处理实验所得数据用±s表示,采用t检验进行各组间比较。

二、结果

1.MTT检测

1)染料木素对JEC细胞体外增殖的影响MTT检测结果显示,随染料木素浓度的增加和时间的延长,染料木素对JEC细胞生长的抑制作用逐渐增强。10-4 mol•L-1的染料木素作用JEC细胞24,48,72和96 h的抑制百分率分别为36.10%,55.00%,58.73%和62.21%,与5Fu间无显著差异(P>0.05)。

2)染料木素对SMMC-7721细胞体外增殖的影响MTT检测结果显示,随着染料木素浓度的增加和时间的延长,染料木素对SMMC-7721的抑制作用逐渐增强。

2.染料木素对JEC和SMMC-7721细胞生长的影响

1)染料木素对JEC细胞生长的影响染料木素对JEC细胞的生长曲线显示,随着染料木素浓度的增加,生长曲线逐渐下移,10-4mol•L-1染料木素的生长曲线呈现与5Fu相似的下降趋势。

2.)染料木素对SMMC-7721细胞生长的影响染料木素对SMMC-7721细胞的生长曲线显示,随着染料木素浓度的增加,生长曲线逐渐下移。

三、讨论

MTT检测结果显示,染料木素对JEC和SMMC-7721细胞体外增殖均有不同程度的抑制作用,呈现剂量和时间依赖性。其中,在96h10-4mol•L-1的染料木素对JEC细胞的抑制百分率达62.21%,对SMMC-7721细胞的抑制百分率为31.87%。表明染料木素对JEC细胞敏感,对SMMC-7721低度敏感。该结果与染料木素对胃癌HGC227细胞系、人肺癌细胞A549和人低分化胃腺癌细胞BGC-823等的抑制作用相似。随着染料木素浓度的增加,JEC和SMMC-7721细胞的生长曲线均逐渐下移。其中,在10-4mol•L-1的染料木素作用下,JEC细胞的生长曲线呈现与5Fu相似的下降趋势,进一步表明染料木素具有一定的抗肿瘤作用。

染料木素是一种很有潜力的癌症化学预防剂,来源丰富,作用复杂,受到广泛关注。研究表明,染料木素具有雌激素作用、抗氧化作用以及抑制拓朴异构酶活性、抑制酪氨酸蛋白激酶活性、诱发细胞程序性死亡、抑制血管生成等作用,但仍不能完全阐明其作用机制。染料木素抗肿瘤的机制有待深入研究。

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