胃轻瘫大鼠胃平滑肌G蛋白表达异常及消痞方干预研究

摘要：目的 探讨胃平滑肌细胞G蛋白在胃轻瘫发病机制中的作用以及中药消痞方的防治效果。方法 健康雄性SD大鼠50只随机分为五组，每组10只，分别为正常对照组、模型组、低剂量治疗组、中剂量治疗组和高剂量治疗组。四氧嘧啶50 mg/Kg静脉注射1次，建立大鼠糖尿病模型， 大鼠给药量按临床成人的剂量，通过体重系数折算成高、中、低剂量，正常对照组和糖尿病模型组给予相应剂量的生理盐水。营养性半固体米糊法测定胃排空率，放射免疫方法测定胃平滑肌细胞cAMP含量。核酸原位杂交方法和计算机图像分析系统对平滑肌细胞的Gsα、GiαmRNA的表达进行定量分析。结果 ①胃排空率：模型组及低剂量组较中、高剂量组和正常组明显减（P

关键词：糖尿病；胃肌轻瘫；胃排空

中图分类号：R587.1

胃轻瘫是糖尿病的常见合并症，包括上腹部饱胀、恶心、呕吐等症状[1]， Kassander在1958年首先提出糖尿病胃轻瘫的概念[2]。关于其发病机制没有完全清楚，目前认为可能和以下因素有关：神经病变、高血糖、胃肠激素及ICC细胞异常等[3]，有关胃平滑肌细胞G蛋白表达在其发病机制中的作用，以及中药的影响目前国内外罕有报道。因此，本文试图探讨胃平滑肌细胞G蛋白在其发病机制中的作用以及中药消痞方的防治效果。

1资料与方法

1.1动物与分组 健康清洁级成年雄性SD大鼠50只，体质量250～270 g，购自中国军事医学科学院。随机分为5组（每组10只）：正常对照组、模型组、低剂量治疗组、中剂量治疗组和高剂量治疗组。

1.2模型制备及标本采集 实验大鼠先稳定3 d，然后给予禁食12 h，尾静脉注射四氧嘧啶50 mg/Kg/次，1 w后测定血糖浓度≥16.7 mmol/L，同时尿糖在（3+）以上确定为糖尿病模型。正常对照组给予等剂量生理盐水注射，余处理同前。实验大鼠分笼饲养12 w，每周监测体重、尿糖、24 h进食量，饮水量、尿量。处死动物后剖腹迅速沿胃大弯剪开胃腔，在装有Kreb液的烧杯内仔细去除胃内容物。剪取胃窦全层1块1 cm×1 cm组织平铺于滤纸上置于10%的福尔马林缓冲液中固定、包埋、切片。

1.3实验用药 消痞方由白术、枳实、党参、炒莱菔子等组成，按比例称取，水煎、过滤，浓缩为3 g/mL。大鼠给药量按临床成人的剂量，通过体重系数折算成高、中、低剂量，分别为20 g/Kg/d， 10 g/Kg/d和5 g/Kg/d，按1 mL/Kg体积灌胃给药，正常对照组和糖尿病模型组给予相应剂量的生理盐水。自造模成功第1 d开始至实验结束，1次/d。

1.4实验数据测定

1.4.1胃排空率测定 参考文献方法[4]胃排空率以（1-胃内容物残留率）表示。实验大鼠禁食不禁水12 h后，给予营养性半固体米糊灌胃，用量为1 mL/100 g，灌胃30 min后脱颈处死大鼠，剖取全部胃肠，自幽门切迹处取胃，拭干称重，沿胃大弯剪开胃体，洗去胃内容物后拭干称净重，计算胃内容物残留率=[（全胃重-胃净重）/半固体米糊重]×100%。

1.4.2胃平滑肌cAMP含量测定 取胃窦组织1块，撕去粘膜和浆膜层，按试剂盒说明进行组织匀浆。采用放免法测定，具体步骤按试剂盒说明进行（I125-cAMP放免试剂盒购自上海中医药大学）。

1.4.3胃平滑肌细胞Gsα、GiαmRNA的原位杂交 同上经石蜡包埋，行5 μm的连续切片，置于Poly-L-Lysine处理过的专用载玻片上。石蜡切片常规脱蜡至水化；3% H2O2室温孵育10 min去除内源性过氧化物酶；滴加消化液室温孵育15 min，以暴露mRN断；滴加预杂交液37℃湿盒孵育2 h；0.2×SSC洗3次，5 min/次；滴加杂交液37℃湿盒孵育4 h；梯度SSC洗涤；滴加封闭液，室温孵育；滴加高敏链酶亲和素过氧化物酶复合物（SABC） 37℃湿盒孵育40 min；PBS冲洗3次，3 min/次；DAB避光显色5 min，水洗中止反应；Giα指标采用AEC显色；复染，脱水，封片。实验设β-actin 为阳性对照，正义探针为探针对照，无探针杂交液为阴性对照。首先在Olympus光学显微镜下初步观察，以胞浆出现棕黄色颗粒（Gsα），亮红色颗粒（Giα）为阳性标志，进一步采用Olympus-BX51计算机图像分析系统采集图像进行半定量分析，每张切片在高倍镜下观察5个视野，测定平滑肌细胞胞浆内阳性物质的光密度，取其平均值进行统计。原位杂交试剂盒购自天津灏洋生物技术有限责任公司。探针序列：Gsα 5'AggTT gTTTT TgATg TCCTg CACTT TggT 3'Giα 5'TggCT CTAAT gATgg CAATg ATggA CTggA 3'

1.5统计学方法 采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。计量资料数据以（x±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，P

2结果

2.1各组血糖、胃排空率和胃平滑肌cAMP含量结果，见表1。

2.1.1胃排空率 模型组较正常组明显减低（P0.05），但较模型组明显增高（P0.05），均显著低于正常组和中、高剂量组（P

2.1.2胃平滑肌 cAMP含量 模型组较正常组明显增高（P0.05），但较模型组明显为低（P0.05），但均显著高于正常组和中、高剂量组（P

2.2胃平滑肌Gsα、GiαmRNA定位表达及定量分析

2.2.1胃平滑肌细胞GsαmRNA的定位表达及定量分析 在各组中胃窦平滑肌细胞的GsαmRNA的表达率为100%，阳性物质呈棕黄色颗粒，位于胞浆内。各组间比较结果显示：中、高剂量组和正常组均显著低于模型组（P0.05）；低剂量组与模型组比较无显著差异（P>0.05），但均显著高于正常组和中、高剂量组（P

2.2.2胃平滑肌GiαmRNA的定位表达及定量分析 在各组中胃窦平滑肌GiαmRNA的表达率为100%，阳性物质呈亮红色颗粒，位于胞浆内。各组间比较结果显示：模型组、正常组、低、中、高剂量组，各组之间无显著性差异（P>0.05），见表2。

3讨论

糖尿病胃轻瘫目前认为起发病机制包括神经病变、高血糖、胃肠激素及ICC细胞异常等因素，但是其核心问题是胃动力障碍。本文采用半固体米糊法测定胃排空率，结果为大鼠糖尿病模型组胃排空率明显低于正常对照组，证实了糖尿病模型大鼠胃排空功能下降，与文献报道结果一致，同时也提示胃轻瘫模型成立。

胃肠平滑肌是胃肠运动的具体执行者。它的活动受到神经、激素和旁分泌机制等的调节[5]。神经递质是通过与平滑肌细胞膜上的G 蛋白藕联受体相互作用而发挥生物学效应的。G 蛋白藕联受体与配体结合后，通过其GTP/GDP结合状态的转化，在细胞的信号转导通路中起信号转换器的作用。其被激活后，调节作为效应器的酶或离子通道的活性，通过影响离子通道的开放或产生的第二信使激活信使依赖的蛋白激酶，从而产生生物效应。G蛋白分为4种亚型：Gsα， Giα， Gq/11α和G12/13α。其中Gsα对效应蛋白起激活作用，Giα对效应蛋白起抑制作用。肌细胞内Ca2+浓度的升高是平滑肌收缩的关键和基础，而介导平滑肌舒张的胞内第二信使主要是cAMP[6]。

腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）是位于细胞膜上的G蛋白的效应蛋白。AC催化ATP分解形成cAMP作为第二信使而发挥生物学效应。AC的活性主要靠Gsα，Giα的调节，Gsα活化后对AC的活性起到激活作用促进cAMP的生成；当Giα活化后对AC的活性起到抑制作用继而减少cAMP的生成。本实验：①通过放射免疫的方法检测胃平滑肌细胞cAMP 的含量，结果显示为糖尿病模型组较正常对照组含量明显增多；②通过核酸原位杂交的方法检测胃平滑肌Gsα，Giα-mRNA的表达，并进行半定量分析，Gsα-mRNA结果显示为糖尿病模型组较正常对照组含量明显增多、Giα-mRNA结果显示为实验的五组之间均无显著性差异。以上结果说明糖尿病模型大鼠胃平滑肌的Gsα-mRNA的表达量增多，Gsα含量增加，可能导致腺苷酸环化酶（AC）活性增加，进一步引起cAMP含量增加，从而引起胃平滑肌收缩力减低，胃动力障碍，胃排空率下降。

中医药是一个伟大的宝库，在治疗胃肠动力性疾病方面有着独特的优势。根据糖尿病胃轻瘫的临床表现，现代中医将其归为"痞满"或"胃痞"的范畴。糖尿病胃轻瘫的“痞满”其病机与糖尿病的基本病机脾虚有着密切的联系[7]，因此认为其病机为脾虚气滞，据此我们提出了健脾理气的治则。消痞方由白术、党参、 枳实、炒莱菔子组成，方以白术为君，健脾祛湿，助脾运化；以枳实下气化滞，消痞除满，为臣。党参，以助白术补脾养胃之功，增加炒莱菔子，消食除胀，助枳实以消痞除满。现代中药研究也证实了白术、党参、枳实、炒莱菔子等具有改善胃肠功能，促进胃肠动力的作用[8]。

本实验通过放射免疫的方法检测胃平滑肌细胞cAMP的含量，结果显示为糖尿病模型组较正常对照组含量明显增多、中高剂量组与正常对照组无显著性差异、低剂量组与模型组无显著性差异，但均高于正常组、中高剂量组；通过核酸原位杂交的方法检测胃平滑肌Gsα，Giα-mRNA的表达，并进行半定量分析，Gsα-mRNA结果显示为糖尿病模型组较正常对照组含量明显增多、中高剂量组与正常对照组无显著性差异、低剂量组与模型组无显著性差异，但均高于正常组、中高剂量组；Giα-mRNA结果显示为实验的五组之间均无显著性差异。

综上所述，消痞方中高剂量组治疗有效，能够通过调节胃平滑肌的Gsα-mRNA的表达量及cAMP的含量维持在接近正常水平，因此推测对于糖尿病胃运动功能具有保护和改善作用。

参考文献：

[1]Hasler WL. Gastroparesis[J].Curr Opin Gastroenterol，2012，28（6）：621-628.

[2]Kassander P. Asymptomatic gastric retention in diabetics[J].Ann Int Med，1958，48（4）：797-812.

[3]姚东英，刘菲.糖尿病胃轻瘫发病机制的研究进展[J].国际消化病杂志，2011，31（1）：16-18.

[4]段长农，程宜福.小鼠半固体米糊法加活性炭测定胃排空[J].皖南医学院学报，2002，21（3）：184-185.

[5]朱玉贤，李毅.现代分子生物学[M].3版.北京：高等教育出版社，1997：315-326.

[6]周吕，柯美云.胃肠动力学-基础与临床[M].北京：科学出版社，1999：212-226.

[7]尚莹莹，黄天生，肖定洪.糖尿病胃轻瘫中医理论及临床研究进展[J].中医研究，2013，26（1）：75-77.

[8]张启荣，李莉，陈德森，等.厚朴、枳实、大黄、陈皮对兔离体胃底平滑肌运动的影响[J].中国中医药科技，2008，15（7）：279-280.编辑/肖慧