α、5-AZA-CdR对白血病细胞HL-60和K562的作用

凋亡(apoptosis)是受基因调控的细胞固有的主动消亡过程,在维持组织稳态中起着极其重要的作用,细胞凋亡受阻是导致肿瘤发病和耐药的主要病理学基础之一。凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis,IAPs)家族是目前已知的唯一的内源性凋亡执行者-天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteine aspartate-specific protease,Caspase)的抑制物,其中XIAP(X-chromosome-linked inhibitors of apoptosis)的作用最强有力[1]。最近从酵母双杂交系统中获得了一种XIAP负调节蛋白-Xaf1(XIAP-associated factor 1),能直接结合XIAP而阻断后者抗Caspase的活性[2]。IAPs在白血病等多种恶性肿瘤中过度表达[3,4],相反,Xaf1广泛表达于所有的正常组织中,但在NCI 60种肿瘤细胞株中表达很低或不能检测到[5]。Xaf1降低不能拮抗XIAP抗凋亡的活性,细胞存活几率增加可能导致了肿瘤的发生[6],通过增加XIAP内源性拮抗剂Xaf1的表达是一个新的癌症治疗靶点。基因工程可以增加肿瘤细胞Xaf1表达并诱导其凋亡[7],但是由于其靶向性差、转染率低、导致基因突变等具体技术问题尚未解决,限制了临床应用。应用化疗药物干扰素(interferon,INF)和5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷(5-aza-2′-deoxycytidine,5-AZA-CdR)[8,9]诱导其表达并促进凋亡可能更切实际。它们是否能在白血病细胞中诱导Xaf1表达尚未见报道。本文通过单独和联合INFα和5-AZA-CdR作用于髓系白血病细胞株HL-60和K562,探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂

HL-60和K562细胞株分别来自中山大学肿瘤防治中心和中山大学动物实验中心。200 mL/L胎牛血清(FCS)购自杭州四季青公司,DMEM低糖型细胞培养液购自Gibco公司。TRIzol Reagent购自Invitrogen公司,ReverTra DashTM RT-PCR Kit和Taq酶购自东洋纺(上海)生物科技有限公司,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司鉴定和合成。Bcl-2、Bcl-xl和Bax抗体购自美国Southern Biotech公司和Labvision公司。JC-1购自美国Sigma公司。Annexin V-FITC/kit细胞凋亡检测试剂盒购自Caltag Laboratoyies公司。IFNα购自美国Sigma公司。5-AZA-CdR购自美国Merck公司。

1.2 细胞培养

髓性白血病细胞株HL-60和K562常规悬浮培养于含10%热灭活(56 ℃,30 min)FBS的DMEM低糖型细胞培养液(pH 7.2~7.4),置于37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度的培养箱中,每2~3 d传代1次。

1.3 药物处理

每孔接种5×105个细胞,分为空白对照组、IFNα组、不同浓度5-AZA-CdR组以及IFNα和5-AZA-CdR联合作用组(共6组),终浓度分别设置为IFNα 1 000 U/mL、5-AZA-CdR 1 μmol/L和5 μmol/L。经上述药物处理48 h后,离心收集细胞备用。

1.4 RT-PCR检测

TRIzol提取细胞总RNA,在10 g/L琼脂糖凝胶电泳下见3条清晰的条带(28 S、18 S、5 S),并用紫外分光光度计检测260 nm和280 nm的吸光度值,计算总RNA的浓度和纯度。根据ReverTra DashTM RT-PCR Kit提示20 μL逆转录体系含总RNA 2 μL、随机引物1 μL、RNase Free H2O 9 μL、5× RT Buffer 4 μL、dNTP Mixture 2 μL、RNase Inhibitor 1 μL、ReverTra Ace 1 μL,42℃ 20 min,99 ℃ 5 min灭活逆转录酶,获得cDNA保存于-20 ℃。取10 μL cDNA、系列特异性上、下游引物各0.5 μL和KOD Dash 1 μL等50 μL反应体系进行PCR扩增,条件94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min,35次循环后72 ℃ 10 min延长。产物经SYBR GREEN I染色后10 g/L琼脂糖凝胶电泳(80 V、40 min),紫外灯下照相,并用凝胶成像分析系统进行半定量分析,以相关基因与内参照G3PDH的比值代表其mRNA水平。Xaf1上游引物5′TCC GGA ATT CAT GCT CCA CGA GTC CTA CTG 3′;下游引物5′ACG CGT CGA CAA ACT CTG AGT CTG GAC AAC 3′,PCR产物为260 bp。XIAP上游引物5′GAA GAC CCT TGG GAA CAG CA 3′;下游引物5′CGC CTT AGC TGC TCT TCA GT 3′,PCR产物为380 bp。内参照G3PDH上游引物5′ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3′;下游引物5′TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3′,PCR产物为450 bp。

1.5 流式细胞检测

1.5.1 Bcl-2家族成员 收集1×106/mL细胞用PBS洗涤2次后重悬为50 μL,加入100 μL FIX&PERM试剂A液,室温放置15 min,PBS洗涤1次,再加入100 μL FIX&PERM试剂B液,分别加入10 μL相应抗体摇匀,4 ℃避光放置20 min,PBS洗涤2次,0.5 mL PBS重悬,细胞仪检测。

1.5.2 线粒体膜电位 收集(1~2)×106/mL细胞用1 mL 37 ℃培养液重悬,加入5 μL 1 mg/mL JC-1充分混匀,37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中避光孵育20 min,离心去除上清并用PBS洗涤两次,重悬后取少量细胞悬液涂片在荧光显微镜下观察,其余送流式细胞仪检测。

1.5.3 细胞凋亡 收集1 × 106/mL细胞用PBS洗涤2次,用稀释的结合缓冲液重悬为(2~5)×105/mL,195 μL细胞悬液加入5 μL Annexin V-FITC混匀,室温孵育10 min,PBS洗涤1次,再用190 μL结合缓冲液重悬,加入10 μL PI,细胞仪检测。

1.6 统计学处理

计量资料以(x±s)表示,采用SPSS 13.0统计软件进行方差齐性检验、单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较采用q检验(Newman-Keuls法),检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 Xaf1、XIAP mRNA的表达

单独用INFα和5-AZA-CdR处理白血病细胞HL-60和K562 48 h可见Xaf1 mRNA表达增加,且与5-AZA-CdR呈剂量依赖性,三者中5-AZA-CdR(5 μmol/L)作用最明显。联合应用INFα和5-AZA-CdR,Xaf1 mRNA的表达亦增加,但与相同剂量的5-AZA-CdR比较无显着性差异(P >0.05)。单独和联合应用INFα和不同剂量的5 -AZA-CdR,HL-60和K562细胞XIAP mRNA的表达无明显变化。