雷公藤多苷对类风湿关节炎患者滑膜细胞VEGF\VEGFR2 mRNA表达的影响

【摘要】目的 探讨雷公藤多苷对类风湿关节炎患者滑膜细胞VEGF、VEGFR2 mRNA表达的影响。方法 取风湿性关节炎导致关节畸形进行关节置换手术病人的关节滑膜组织进行原代培养，传代后进行雷公藤多苷干预，利用实时荧光定量PCR检测滑膜细胞中VEGF、VEGFR2 mRNA表达水平情况。结果 成功自人滑膜组织中培养出成纤维样滑膜细胞，雷公藤多苷干预后滑膜细胞中VEGF、VEGFR2 mRNA表达水平降低。结论 阻断VEGF/VEGFR2信号通路，从而抑制血管生成是雷公藤多苷有效治疗类风湿关节炎的途径之一。

【关键词】类风湿关节炎 雷公藤多苷 实时荧光定量PCR VEGF；VEGFR2

中图分类号：R593.21 文献标识码：B 文章编号：1005-0515（2011）4-045-02

The influence of tripterygium glycosides in VEGF, VEGFR2 mRNA expression of synovial cells in patients with rheumatoid arthritis

Wang Jia1,2 Li Qian1 Gao Feng2 Yang Xuewen1，2*

（1 Nanjing University of Chinese Medicine,2 Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine）

【Abstract】Objective To investigate tripterygium glycosides in VEGF, VEGFR2 mRNA expression of synovial cells in patients with rheumatoid arthritis. Methods Synovial tissue of rheumatoid arthritis leading to joint deformity which is joint replacement surgery patients were cultured and intervented by tripterygium glycosides. Real-time fluorescence quantitative PCR detection of the VEGF, VEGFR2 mRNA expression of synovial cells was used.Results Successfully cultured fibroblast-like synoiocytes(FLS ) cells,after the intervention of tripterygium glycosides(TwP)to synovial cells the VEGF, VEGFR2 mRNA expression decreased.Conclusion Blocking VEGF/VEGFR2 signaling pathway, thereby inhibiting angiogenesis is one of the effective means of tripterygium glycosides to rheumatoid arthritis.

【Key words】rheumatoid arthritis TwP real-time quantitative PCR VEGF VEGFR2

血管翳是一种以血管增生、炎性细胞浸润为特征的滑膜组织，其形成是类风湿关节炎(RA)的重要病理特征，新生血管形成即从原有的微血管处形成新的毛细血管，是产生和维持RA血管翳的主要因素[1]，成纤维样滑膜细胞则认为是RA病理改变的最终靶细胞[2]。近年来，人们己经认识到血管生成在RA的侵蚀和破坏过程中发挥了重要作用，中断血管生成在RA的治疗中有着重要的意义[3]。雷公藤多苷是驱风湿的常用药，具有抗炎及免疫抑制和抗肿瘤等作用[4, 5]，有研究认为雷公藤多苷能显著改善CIA大鼠膝关节滑膜炎症、增生、新生血管生成等病变[6]，但未从血管生成的机制上进行阐述。我们取临床因RA导致关节畸形需进行关节置换手术病人的关节滑膜组织进行原代培养，获得成纤维样滑膜细胞，传代后进行雷公藤多苷干预，分析滑膜细胞血管生成相关因子VEGF、VEGFR2 mRNA表达水平情况，进行VEGF/VEGFR2信号通路分析。

1 材料和方法

1.1 标本来源 人滑膜组织取自我院2009年3月至2010年2月由于风湿性关节炎导致关节畸形，进行关节置换手术病人的关节滑膜组织18例。

1.2 试剂和仪器 高糖型DMEM（美国Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（美国Gibco公司），台盼蓝染色液（北京赛驰生物公司），含雷公藤多苷、沙利度胺的大鼠血清（本院动物中心提供）, Trizol、DNA marker（大连TaKaRa公司），M-MLV等逆转录试剂、Taq酶（美国MBI公司）。引物、探针、标准品构建委托由Invitrogen公司合成，实时荧光PCR系统（美国ABI ABI7500）。

1.3 滑膜细胞培养 组织剔除血管及脂肪组织，PBS洗涤2次，加入1ml 0.2%胰酶，眼科剪反复锐性切碎，使组织至1mm3大小，加入等量DMEM 完全培养基，离心去上清，再加入1mlDMEM 完全培养基，混匀，均匀铺于培养瓶的底部，微微倾斜培养瓶，吸弃多余培养基，倒置培养瓶，加入5mlDMEM 完全培养基，放入5%二氧化碳培养箱，培养2小时。轻轻翻转培养瓶，让DMEM 完全培养基慢慢淹没已贴壁的组织小块，放入5%二氧化碳培养箱，培养48小时，每3天换液一次，当细胞爬出较多后，去除组织小块，更换培养液，爬满后，胰酶消化，转入10ml离心管中，离心弃上清，PBS液洗涤3次。

1.4 细胞存活率鉴定 加入DMEM培养基，配制成滑膜细胞悬液(5 ×105 / L)，取滑膜细胞悬液(5 ×105 / L)0.1ml加入到EP管内，加入100微升台盼蓝染色液，吹打混匀，5分钟，血细胞计数板计数，计算细胞存活率。

1.5 细胞培养给药 加入DMEM 完全培养基，配制成滑膜细胞悬液(5 ×105/L) 1ml加入6孔板中继续培养48h，换液，6孔为空白对照孔，6孔为雷公藤多苷组，6孔为沙利度胺组，继续培养96h，胰酶消化并收集细胞，离心去上清备用。

1.6 人滑膜细胞总RNA提取 取1×106滑膜细胞经无菌PBS洗涤、离心后取沉淀，加入500μl Trizol消化，经氯仿萃取、异丙醇沉淀，75%DEPC乙醇洗涤后，干燥10分钟，加入30μlDEPC水溶解，-70℃贮存备用。

1.7 逆转录：参照前期论文[7]。

1.8 PCR引物、探针的设计 根据GenBank提供VEGF mRNA序列（E14233）、VEGF R2 mRNA序列（AF063658）、GAPDH mRNA序列（NM_002046），采用Primer Express 2.0软件进行引物和探针设计（跨内含子），并经Blast验证；探针 5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记TAMRA荧光淬灭基团（具体引物序列见表1）。

表1 人VEGF、VEGFR2、GAPDH引物探针序列

1.9 标准品的构建：参照前期论文[7]。

1.10、PCR反应：①VEGF、VEGFR2、GAPDH反应体系相同，模板0.5μl，10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP(10mM) 0.5μl，MgCl2(25mM) 1.0μl，Primer(10mM) 各0.25μl，Probe(10mM) 0.25μl，50×ROX dyeⅡ 0.5 μl，TaqDNA聚合酶 1.25U，去离子水补足 25 μl。②反应条件，VEGF为94℃预变性2min，94℃15sec、59℃35sec扩增40个循环，72℃ 5min。在59℃35sec读取荧光。VEGFR2为94℃预变性2min，94℃15sec、51℃35sec扩增40个循环，72℃ 5min。在51℃35sec读取荧光。GAPDH为94℃预变性2min，94℃15sec、53℃35sec扩增40个循环，72℃ 5min。在53℃35sec读取荧光。

1.11 统计学处理 取VEGF、VEGFR2相对于GAPDH的表达量（即VEGF/GAPDH、VEGFR2/GAPDH）进行统计分析，所有数据均用±2s表示，应用SPSS13.0统计软件做统计分析，不同组间用方差分析，两两比较用SNK法。以P

2 结果

2.1 滑膜细胞的生长及形态及存活率鉴定 成功以RA患者滑膜组织培养出滑膜细胞，生长情况良好，细胞排列紧密，表现为梭形、星形、多角形、树突形等形态上的多样性，细胞核呈卵圆形位于细胞中央（见图1）。存活率鉴定中，每个样本留取液随机检测10次后取平均值，计算其活力均大于96 %，活力良好。说明自人滑膜组织中成功分离培养出成纤维样滑膜细胞，并成功传代，为后期药物干预实验，VEGF、VEGFR2 mRNA表达水平在RA发生发展中作用的研究奠定了基础。

图1 清膜成纤维细胞

2.2 PCR反应曲线及标准品相关曲线：PCR反应曲线平滑，呈典型的S型，相关曲线r>0.99， PCR结果可靠。

2.3 人滑膜细胞中VEGF、VEGFR2的mRNA表达水平：与对照组比较，雷公藤组，沙利度胺组VEGF、VEGFR2 mRNA表达水平降低（P＜0.05），雷公藤多苷组，沙利度胺组比较VEGF、VEGFR2 mRNA表达水平无差异（P＞0.05）（见表2），说明抑制血管生成是雷公藤多苷有效治疗RA的途径之一。

表2 人滑膜细胞VEGF、VEGFR2 mRNA相对表达水平

注：与对照组比较，*P

3 讨论

滑膜细胞的原代培养方法基本上可分为组织块培养法和酶消化法，两者各有不足，我们在原代培养中进行了折中，在剪碎组织的过程中加入胰蛋白酶，从而有效的打散组织结构，使组织更为轻薄，易于贴壁，贴壁后也更加容易爬出，同时也减少了污染机会，更多更好的获得滑膜细胞，为实验的成功开展奠定了基础。

VEGF是一种相对分子量在34000~46000的同源二聚体糖蛋白，特异性作用于血管内皮细胞，由8个外显子和7个内含子组成，由于mRNA的不同拼接，形成6种VEGF异型体，分别是VEGFl21、VEGFl45、VEGFl65、VEGFl83、VEGFl89和VEGF206[8,9]。VEGF家族成员发挥生物学效应主要是通过结合特异性血管内皮生长因子受体（VEGFR）进而激活引起胞内酪氨酸残基交叉磷酸化而实现的[10]。VEGF对内皮细胞的增值、分化作用主要是由VEGFR2介导的，由VEGFR2介导信号传导主要通过三种途径：①p38MAPK通路，②RAS-MEK-ERK通路，③P13K-Akt/PKA途径[11]。

RA早期的主要病理变化是滑膜的微血管数量增加形成滑膜血管翳，滑膜血管翳则主要由持续增生的成纤维样滑膜细胞和新生血管构成[10, 12]。RA血管新生可分为3个基本过程：①炎症介质激活内皮细胞；②蛋白酶降解血管内皮基质；③内皮细胞趋化及新生血管形成。滑膜及滑膜液的VEGF表达有助于血管新生，VEGF作用于新生血管早期[12]，多种调节因子致VEGF持续高表达，结合其受体通过信号转导从而促进血管形成，增加血管通透性，导致了RA的持续滑膜炎及血管翳形成。由于RA患者异性高表达VEGF165和其受体VEGFR2[14]，因此认为在血管形成作用中，VEGF结合VEGFR2起到主要作用，研究两者之间的相互作用有助于了解RA的发病机制。

我们的研究结果是雷公藤多苷及沙利度胺均有效下调RA患者滑膜细胞VEGF、VEGFR2 mRNA表达，提示阻断VEGF/VEGFR2信号通路，从而抑制血管生成是雷公藤多苷有效治疗RA的途径之一，而其具体途径是我们后续研究的重点。

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