时间：2022-09-25 09:45:07
摘要：为仙客来（Cyclamen premium Mill）叶斑病的起源、发生、传播和防治研究提供形态解剖学依据，利用石蜡切片和扫描电镜观察患叶斑病的仙客来叶片，研究病原菌在叶片中的分布和侵染特点。结果表明，叶斑病病原菌先通过菌丝从叶片气孔侵入，进入海绵组织中产生孢子，再向其他部位蔓延。叶斑病病原菌在侵染过程中产生了垫、塞和钉状的特殊侵染结构。
关键词：仙客来；叶斑病；侵染特点；侵染结构
中图分类号：S436.8 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）14-3302-04
仙客来（Cyclamen premium Mill）为报春花科（Myrsinaceae）仙客来属（Cyclamen）多年生球根草本植物，是世界著名的节日小盆花之一。仙客来叶斑病（Leaf spot disease）是近几年发生并报道的一种新的叶部病害，发病率一般为20%～30%，严重时可达50%，给生产造成了巨大损失。叶斑病在3月上旬始见，5～6月为流行高峰期。病害发生主要与气候、栽培管理和品种密切相关[1，2]。叶斑病是春季温室中仙客来的多发病，危害严重，发病速度快，暴发力强[3]。目前有关仙客来叶斑病的研究主要集中在病原鉴定、诊断和防治等方面[4]，而对患病植株组织内部变化研究报道较少，对患叶斑病叶片细胞超微结构的变化过程研究不够详细全面，缺乏系统性。本研究对患叶斑病的仙客来叶片显微结构进行了系统观察研究，以期揭示叶斑病侵染特点，为进一步研究仙客来叶斑病的起源、发生、传播及防治提供解剖学依据。
1 材料与方法
取患叶斑病的仙客来植株和正常仙客来植株的叶片，患病叶包括以下时期：时期I，叶无明显变化到叶背面花斑无明显增加，叶较正常；时期Ⅱ，出现小型斑点，但叶片整体状态较好；时期Ⅲ，出现大型斑点，叶片出现干枯症状；时期Ⅳ，叶片出现大量斑点，叶片接近完全干枯。利用石蜡切片技术处理样品（切片厚度10 μm），经过番红-固绿滴染和番红-固绿-龙胆紫滴染后封固，在光学显微镜下观察，并用电子显微镜观察仙客来叶表皮。
2 结果与分析
2.1 病原菌侵染仙客来叶片的位置
仙客来叶斑病的典型特点就是在叶片上形成一些斑点，从而影响其观赏性。在病原菌侵染时，叶片发病多从叶缘开始，有时也从叶中部始发，初期叶片上产生淡绿色水渍状小圆斑，后期病斑扩展、呈淡褐色、边缘下陷，由于受叶脉限制，愈合成不规则的大病斑，具不明显的暗色轮纹，中央灰白色，危害严重时病斑中央枯死。试验对叶斑病病菌侵染不同时期的仙客来叶片进行石蜡切片观察，采用番红-固绿双染法和番红-固绿-龙胆紫三染法进行染色，在双染法中植物细胞内的菌丝被染成绿色，而孢子被染成红色；在三染法中，正常细胞壁被染成绿色，孢子为红色，菌丝为紫色。从观察结果（图1）可以看出，叶斑病的病原菌大部分是从叶片的下表皮气孔处开始侵染，同时在保卫细胞中产生菌丝，然后在叶肉细胞中产生大量的分生孢子，从而实现在植物叶中的传播，在扫描电镜观察中也看到了相同的现象。病原菌的大部分侵入点在下表皮的气孔位置，只有在叶片已经枯萎时，才在叶片上表皮看到一些侵入点，这些侵入点形成的原因可能是在病原菌的作用下，叶片表皮的角质层受到破坏，同时表皮细胞受到破坏。
2.2 叶片中病原菌的分布情况
观察不同时期的仙客来叶片的解剖结构，病原菌在叶片不同组织中分布情况及状态见表1。从表1可见，叶片中菌丝与孢子对下表皮和叶肉组织侵染严重，上表皮侵染较轻，而叶脉没有侵染迹象。菌丝的分布多为絮状，并且成团，孢子为颗粒状（图1B），菌丝与孢子充满并破坏细胞。菌丝在叶片海绵组织、下表皮、栅栏组织中的分布呈现出逐渐增多的趋势，而孢子主要分布在海绵组织，表明病原菌可能是通过菌丝侵入叶片，然后进入海绵组织产孢，进而形成菌丝，再向其他部位蔓延。
2.3 仙客来叶斑病病原菌侵染过程
通过扫描电镜观察不同时期的仙客来叶片，从而确定病原菌的侵染过程。发现叶斑病病原菌通过叶片下表皮气孔侵入叶片内部。正常叶片表皮细胞排列紧密，外面覆盖厚的角质层，气孔正常，外形规则，并且保卫细胞饱满（图2A）。在侵染初期，一些孢子附着在叶片的下表皮上，向气孔内形成菌丝，然后侵入闭合气孔，这些菌丝快速生长发育并大量繁殖。一部分穿过气孔进入叶片内层细胞中，通过菌丝将孢子带入内层细胞中，破坏叶片内部组织，石蜡切片也观察到相同的结果（图1A）。另一部分病原菌向外生长破环气孔的保卫细胞，使其失活无法收缩，并且继续破坏气孔，使其逐渐失水收缩（图2B）。
随着侵染进程的发展，菌丝继续生长并且在气孔处集结形成了一些垫、塞和钉状结构（图3），在侵染后期，这些侵染结构不断堆积，会形成锥、柱等不规则结构，并出现了断裂、坍塌的现象。在这些结构中可以看到大量孢子，而落在表皮上的孢子又开始萌发，产生新的菌丝，继续侵染临近气孔。
在侵染末期，叶片表皮细胞开始失水萎缩，角质层受到严重的破坏，完好气孔较少，几乎所有的气孔都有侵入结构出现。这时叶片的外部表现为出现了大块的斑点。随着斑点的增加，叶片逐渐出现枯死和变黄的现象。扫描电镜对叶斑病的病原菌及气孔在病原菌侵染过程的变化情况观察结果见表2。
由电镜照片（图4）可以看出，在病原菌侵染过程中，病原菌的孢子形状为椭圆形，直径0.82～4.91 μm，并且在刚刚形成时，虽然细胞较小，但是马上就进行了萌发从而产生了大量的菌丝，继续对叶片进行侵染，这可能也是仙客来叶斑病传播速度较快的原因之一。在病原菌对叶片的侵染过程中，气孔发生了巨大的变化，正常气孔的直径为44.10 μm，而受到破坏后其直径缩小为19.50 μm，表明在病原菌侵染过程中，保卫细胞明显缩水变形。气孔受到破坏时也失去了正常的功能，始终处于张开状态。
随侵染症状加剧，菌丝形成的外部结构逐渐变大发生破碎，破碎面呈针状、栅栏状，释放出大量孢子。通过石蜡切片观察，发现孢子多聚集在菌丝边缘部位，推测孢子是通过菌丝传递到气孔，并传递到叶肉细胞内部，使侵染面积扩大。观察发现，随着侵染症状加剧，叶下表皮的孢子数呈先增加后减少的趋势，说明大部分的孢子已转移到叶片内部，叶表皮已经被破坏。
3 讨论
3.1 组织学观察和细胞学观察的方法比较
植物结构常使用组织学观察和细胞学观察，组织学观察采用光学显微镜，标本制作常用石蜡切片方法，细胞学观察常采用电子显微镜。本试验采用石蜡切片并结合不同的染色方法对仙客来叶斑病病原菌侵染特点进行了观察，双染法将细胞和菌丝染成绿色，孢子染成红色；三染法将菌丝染成紫色、细胞染为绿色、孢子染为红色，更易分辨其结构，是观察植物体内病原菌情况的较好方法。在试验中，特别是采用三染法的时候，一定要控制好各个药品的染色时间，才能保证制片染色均匀。龙胆紫和固绿较容易着色，染色后应立即清洗，番红较难着色，应多染些时间，染色为2～3 min。电子显微镜与光学显微镜相比，操作时间短，工序更简单，而且可以更清晰观察组织变化、较准确测量孢子的大小。
3.2 仙客来叶斑病的侵染结构
植物病原菌要实现对植物体的侵害，必须先侵入到植物体中[5]。病原菌在入侵寄主时，通常会产生一些由特化菌丝形成的侵染结构，如侵染垫（Infection cushion）[6，7]、附着胞（Appressorium）[8]、侵染钉（Penetration peg） 、吸器（Haustorium）[9，10]，帮助入侵并与寄主建立寄生关系。病原菌在侵染植物时，多数是菌丝体直接穿过表皮细胞或细胞间隙。病原菌侵染可归纳为以通过特殊的侵染结构（侵染垫或裂片状附着胞）进行侵染和由菌丝顶端直接穿透植物表面或从自然孔口（主要是气孔）及伤口直接侵入两种情况[11，12]，具体情况与菌株和寄主不同有关系。
在对仙客来叶斑病病原菌侵染过程观察中，发现菌丝在气孔形成了一些特殊的侵染结构，这些结构由菌丝构成，开始为较小的塞和钉状结构，随侵入过程的发展，这些结构形成较大的锥和柱等不规则结构。叶片的表皮细胞在侵染后期出现缩水和萎缩现象，没有发现菌丝直接穿透表皮细胞，可见叶斑病对叶片的侵染是通过产生特殊结构的方式来实现的。随侵染症状的逐渐加剧，菌丝形成的外部结构逐渐变大破碎，破碎面呈针状、栅栏状，释放出大量孢子。通过石蜡切片观察，发现孢子多聚集在菌丝边缘部位，推测孢子是通过菌丝传递到气孔，并传递到叶肉细胞内部，使侵染扩大。观察发现随着侵染症状加剧，叶下表皮的孢子数呈先增加后减少的趋势，说明大部分的孢子已转移到叶片内部，表皮已经被破坏。
参考文献：
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