保证免疫组化染色质量的几个要点

[摘要] 免疫组化染色是临床病理学的重要诊断手段之一，该染色步骤繁琐且每一步都可能影响染色的最终结果，因此保证染色质量是贯穿于免疫组化实验全过程的核心。欲得到一张高质量的免疫组化染色片，必须做好组织固定和制作蜡片的基础工作，准确掌握抗原修复的时间和温度，严格按照染色步骤进行操作。

[关键词] 免疫组化；染色；组织固定；抗原修复

[中图分类号]R446.8 [文献标识码]C [文章编号]1673-7210（2007）09（a）-144-01

免疫组化染色目前已成为临床病理学的重要诊断手段之一，其作用毋庸置疑，同时还可用于鉴别诊断、评估预后、指导化疗等方面。一张良好的免疫组化染色片是正确判断染色结果的基础和前提，但免疫组化染色步骤繁琐且每一步都可能影响染色的最终结果，故保证染色质量是贯穿于免疫组化实验过程的核心。要得到一张高质量的免疫组化染色片，不是一件容易的事。如同苏木精―伊红染色一样，需要病理技术员和病理医生的互相配合、协调、共同努力。尽管如此，工作中我们还是常常遇到各种问题。笔者通过临床工作和实践，总结如下，仅供同行们参考。

1 组织固定

固定的目的之一是最大限度地保存组织细胞内的抗原性。固定液选用10%缓冲福尔马林液。组织离体后，应尽快（最好在30 min内）固定12~24 h。这样做是因为临床实际工作中，手术量往往较大，而且经常是标本送来后的第2天取材。取材后，常常即刻进入全自动脱水机程序化处理，个别标本不能得到及时、充分的固定。因此，我们采取的方法是手术标本送来后，即刻将大标本剖开，及时固定，保持固定液在组织的10倍以上，以免蛋白质变性，抗原丢失。特别是夏季更应慎重。

免疫组化染色过程长，步骤多，且抗原修复时需要加热至95℃以上，虽然经过及时固定组织块和APES胶处理玻片，组织片仍偶有脱落、破碎、不完整或边缘卷起的现象，影响镜下观察。我们发现，边缘卷起的切片一般都有假阳性染色。如何解决这一问题呢？我们的做法是首先做好组织的前期处理，从第一步组织取材开始到包埋结束，每一步都要严格规范化，取材厚度不超过3 mm。控制好固定、脱水、透明、浸蜡每个步骤的时间、温度，真正做到充分、合理。经过这样处理后的优质蜡块，再加上锋利无痕的刀具，娴熟的切片手法，切出一张薄而完整、均匀的切片应该不是一件难事。其次，烤片是一个不容忽视的环节，它较苏木精―伊红染色时间长，一般热修复高压法烤片要3 h以上，温度要求高于包埋蜡2℃。这样就尽量克服了上述的不足，大大减少了医生阅片时的困难。

2 抗原修复

由于甲醛固定时，组织中许多分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭，相当部分抗原不能与抗体很好地进行反应。因此，抗原修复是做好免疫组化染色的关键环节。目前，用作抗原修复的方法有两种：热修复和酶消化。热修复包括高压、微波、水浴。我们认为高压法较易掌握，临床应用广泛。酶消化有胃酶和胰酶两种消化。热修复用于大多数抗原，尤其是核抗原，如PR、ER、Ki67、p53等。抗原修复液一般用0.1 mol/L柠檬酸或柠檬酸盐液，pH为6.0。胰酶消化适用于细胞内抗原；胃酶消化适用于细胞间抗原。还有些抗原需双暴露法，即热修复+酶消化。总之，应严格按照抗体说明书要求进行修复。

3 严格按照染色步骤要求操作

整个免疫组化过程步骤多，过程长。每一步都应严格按照要求进行操作，如脱蜡时间一定要充分；室温过低时，应先将二甲苯放入温箱加热，脱苯用的酒精也应设法加热以充分脱苯。其他染色步骤所用的试剂，也是如此。室温过低时应尽量设法提高试剂的温度（利用水浴箱、热台等），否则易导致染色失败。每一步PBS（pH为7.2~7.4）冲洗时间、次数一定不能省略，因PBS液内含有盐，可以减少背景染色。

4 显色反应

作为临检工作的免疫组化染色，由于每次试验所作标本、组织来源不同，抗原含量不等。因此，切片显色要求镜下观察，控制显色时间。最好先看苏木精―伊红切片，了解基本病变，熟悉抗体定位特点，排除假阳性着色干扰，找准切片中的病变位置。滴加显色剂时，一次不要加得过多，以免来不及观察，而致显色过度。有些抗体如CD系列显色反应较快，应先镜下观察，ER、PR等抗体显色较慢，可以稍往后放。显色程度的控制，可观察红细胞稍着淡黄色即终止显色，时间不宜过长，以免导致泛染。

[参考文献]

[1]周小鸽. 免疫组化染色过程中存在的问题及对策[J].诊断病理学杂志,2004,11(4):4-6，86.

（收稿日期：2007-07-26）