丹参素靶向乙肝病毒逆转录酶抗乙肝及抗原表达影响机制研究

[摘要]该文采用MTT法测定丹参素对转染人肝癌细胞株（HepG2）的2215细胞活性的抑制作用，通过间接荧光标记法测定细胞内活性氧水平的变化；采用ELISA法测定细胞上清乙肝表面抗原（HBsAg）和E抗原（HBeAg）水平，采用荧光定量PCR法检测HBV DNA水平；利用酶抑制动力学方法，研究了丹参素对HBV RT的抑制作用；最后利用圆二色谱法监测丹参素对HBV逆转录酶二级结构的影响。结果显示丹参素能够对HepG2215细胞的生长起到良好的抑制作用，半抑制浓度IC50为（1535±243） μmol・L-1；丹参素能显著抑制HBsAg和HBeAg表达，同时对HBV DNA复制具有抑制作用；此外，丹参素是一种有效的HBV逆转录酶抑制剂[半抑制浓度IC50为（2132±243）μmol・L-1]，荧光标记法检测，细胞内活性氧水平随着丹参素呈浓度依赖性升高；圆二色谱分析表明丹参素诱导HBV逆转录酶的构象发生部分改变，α螺旋含量逐渐增加。结果表明丹参素能够通过结合HBV逆转录酶，诱导酶的结构变得紧密，而不利于活性中心的形成，最终使HBV逆转录酶活性降低。而这种诱导酶的活性降低直接影响到乙肝病毒DNA的复制，加之抗原水平的降低，增加了丹参素抗乙肝病毒的药效。

[关键词]丹参素；HepG2215细胞；乙肝病毒逆转录酶；活性氧；二级结构；抑制作用

[Abstract]MTT assay was used in this study to investigate the inhibitory effect of danshensu on the activity of 2215 cells among human hepatoma cell line （HepG2）； indirect fluorescence labeling method was used to measure the changes of reactive oxygen levels in the cells； ELISA method was used to determine hepatitis B surface antigen （HBsAg） and hepatitis B e antigen （HBeAg） levels in cellular supernatants； HBV DNA level was measured with fluorogenic quantitative PCR method The inhibitory effect of danshensu on HBV RT（hepatitis B virus reverse transcriptase） was studied by using enzyme inhibition dynamics， and the effect of danshensu on secondary structure of HBV reverse transcriptase was monitored by using circular dichroism The results showed that danshensu had a good inhibitory effect on the growth of HepG2215 cells， with a half inhibitory concentration （IC50） of （1535±243） μmol・L-1； danshensu could significantly inhibit HBsAg and HBeAg expressions， and showed an inhibitory effect on HBV DNA replication In addition， danshensu was an effective inhibitor for HBV reverse transcriptase [IC50 （2132±243） μmol・L-1] The fluorescence labeling results showed that the reactive oxygen levels in the cells were increased with the increase of danshensu concentration Circular dichroism analysis showed that danshensu could induce partial change of conformation of HBV reverse transcriptase and gradually increased αhelical content These results indicated that danshensu could make the structure of the enzyme become closer by binding to HBV reverse transcriptase， which was not conducive to the formation of the active center， so it could finally decrease the activity of HBV reverse transcriptase Such decrease in enzyme activity would directly affect the HBV DNA replication， and combined with the decrease of the antigen levels， the effect of danshensu on HBV was increased

[Key words]danshensu； HepG2215 cells； reverse transcripatase of HBV； reactive oxygen species； secondary structure； inhibitory effect

doi：10.4268/cjcmm20160722

丹参素（danshensu）属于酚性芳香酸类化合物，大量存在于丹参类植物中；丹参素有多种药理活性[12]，对心肌缺血的保护作用，抑制血小板聚集及抗凝作用，对动脉粥样硬化的拮抗作用及降血脂作用，抗菌消炎及增强机体免疫作用和抗肿瘤作用，而其中其对肝脏的保护作用在近年来受到广泛关注，蒋莉等[3]研究发现丹参素能够对内毒素引起的肝损伤起到良好的保护作用；郑元义等[4]发现丹参素能够对免疫性肝纤维化有明显的抑制效果。大量研究表明慢性乙型肝炎（HBV）所引起的感染，能够导致肝硬化和肝癌的发生，因此乙肝病毒的逆转录酶在病毒复制中具有十分重要的作用，可作为研究抗病毒药物丹参素的重要靶点[5]，为丹参素在乙肝病毒治疗领域的开发和应用提供实验依据。

1材料与方法

11细胞株乙型肝炎病毒（HBV）DNA转染人肝癌细胞株（HepG2）的2215细胞 （中国科学院典型培养物种保藏委员会细胞库），在本实验室进行培养。

12仪器与试剂丹参素（分析对照品，20 mg）购自Sigmaaldrich（上海）贸易有限公司；拉米夫定（01 g/片）购自CiplaLtd公司，批号G25193；RPMI 1640 培养基购自赛默飞世尔生物化学 （北京）有限公司；优级肽牛/小牛血清购自澳大利亚 PAA 公司；CaspaseGlooR3检测试剂盒购自Sigmaaldrich（上海）贸易有限公司；胰蛋白酶购自美国 Gibco公司；二甲基亚砜（DMSO）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT，5×103 mg・L-1，PBS配制）购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。酶标仪SpectraMax Plus384购自美谷分子公司；生物安全柜，型号HR40ⅡA2 Haier，购自青岛海尔医用低温科技有限公司；pHS3C型酸度计购自上海雷磁仪器厂；BioRad680型酶联检测仪，MOS 450型圆二色谱仪购自法国BioLogic公司；GWAUN2超纯水仪购自北京普析通用仪器有限责任公司；流式细胞仪（FACSAria）购自美国Becton Dikinson公司。

13细胞活性检测[6]将对数生长期HepG2215细胞以 1×105个/孔接种于96孔板，200 μL/孔，置于恒温恒湿培养箱培养。培养24 h后，分别加入不同浓度的丹参素和拉米夫定培养基，每个药物3个平行孔。分别培养24 h 后，每孔加入5 g・L-1 MTT 20 μL，放入培养箱，继续培养4 h。吸出培养基，每孔加150 μL DMSO，用振荡器充分振荡，使结晶充分溶解，用酶标仪测定各孔在 570 nm处的吸光度（A）。根据A计算，细胞活性=A实验组/A对照组×100%。

14流式细胞仪检测HepG2215细胞内ROS[7]将对数生长期HepG2215细胞以1×105个/孔接种于96孔板中，置于恒温恒湿培养箱培养。培养24 h后，分别加入5，10，25，50，100 μmol・L-1的丹参素和拉米夫定（10 μmol・L-1）培养基，同时设空白对照，每个药物3个平行孔。培养48 h后，收集细胞用PBS重新悬浮细胞，首先加入5 μL的FITCAnnexin V避光染色5 min，然后再加入10 μL的PI避光染色15 min，在室温下避光孵育15 min。取样后，加入到流式细胞仪，进行荧光强度检测。

15丹参素体外抗HBV作用[8]以转染HBV基因的HepG2215细胞为模型，对丹参素的抗HBV作用进行评价，评价指标为细胞培养上清中的HBsAg，HBeAg，HBV DNA含量。将HepG2215细胞用胰蛋白酶EDTA消化并稀释成50×104个/mL，接种200 μL于96 孔板中培养。待细胞贴壁后倾去培养基，加入用培养基稀释成不同浓度的丹参素（5，10，25，50，100 μmol・L-1）和拉米夫定（10 μmol・L-1），同时设空白对照。提取培养上清，用ELISA试剂450 nm处测定培养基中HBsAg和HBeAg吸光度，抑制率=（A空白组-A抑制剂）/A空白组×100%。并用HBV DNA定量PCR试剂测定培养基中HBV DNA浓度。

16HBV逆转录酶活性检测参照王晨吟等[9]方法，将丹参素和拉米夫定100 μL加入到96 孔培养板中，并加入20 μL含逆转录酶的PBS溶液、70 μL的 RT Buffer，在37 ℃水浴1 h后，用洗液清洗3次，除去未结合的游离底物，再向每孔中加入100 μL BSA （1%） 溶液，在室温下进行30 min的封闭，之后洗板，并再向每孔中加入50 μL的SAALP稀释液，在37 ℃水浴 1 h后洗板，最后向每孔中加入底物 PNPP（1 g・L-1）50 μL。在405 nm波长下，利用酶标仪进行测定A，计算酶的抑制率=（A空白对照孔-A实验孔）/ A空白对照孔×100%。

17圆二色光谱的测定将不同浓度的丹参素加入到HBV逆转录酶的溶液中，混合均匀，以pH 75的磷酸盐（50 mmol・L-1） 缓冲液做空白，测定样品在37 ℃下的CD光谱。

18统计学分析本文采用SPSS 180统计软件对各组中HepG2215细胞活性、HBV逆转录酶抑制率和体外抗HBV作用以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P

2结果与分析

21丹参素对HepG2215细胞生长的抑制作用解析丹参素和拉米夫定对HepG2215细胞生长的半抑制浓度IC50分别为（1535±243），（1165±201） μmol・L-1；丹参素对HepG2215细胞生长的抑制能力与拉米夫定相当，无显著性差异，见图1。

22丹参素诱导HepG2215细胞内ROS的产生细胞内活性氧水平结果见表1，丹参素能够提高HepG2215细胞内活性氧水平，且呈浓度依赖性升高。加药组与对照组比较，具有显著性差异（P

23丹参素的体外抗HBV作用丹参素作用细胞1周后，在一定浓度范围内，都能够显著抑制HBsAg和HBeAg表达，其最高抑制率分别为5718%，6234%；同时在10，25，50，100 μmol・L-1浓度下对HBV DNA的合成具有明显抑制作用，见表2。

24丹参素对HBV逆转录酶活性的抑制作用丹参素对HBV逆转录酶的抑制作用见图2，随着丹参素浓度的增加，HBV逆转录酶的活性呈不断下降的趋势，直到丹参素的浓度达到100 μmol・L-1后，HBV逆转录酶的相对活性趋于平缓；解析其半数抑制浓度（IC50）为（2132±243） μmol・L-1，略高于阳性对照拉米夫定的IC50 （1644±189） μmol・L-1，显示出丹参素对HBV逆转录酶有良好的抑制效果。

25丹参素对HBV逆转录酶二级结构的影响应用在线Dichroweb软件计算出HBV逆转录酶与丹参素结合前后的二级结构含量，结果见表3。从表中可以看出游离HBV逆转录酶的α螺旋质量分数为356%，β折叠质量分数为200%，是典型的α螺旋型蛋白类，当向HBV逆转录酶中加入丹参素的浓度达到100 μmol・L-1时，α螺旋质量分数增加到485%，β折叠质量分数减小到89%，这表明丹参素会诱导HBV逆转录酶构象发生了部分变化。

3讨论

乙型肝炎是严重危害人类健康的传染病，目前尚无根治的特效药物和方法；众所周知，逆转录酶催化的反应也叫反转录 （reverse transcription）。在这个过程中，遗传信息流HBV逆转录酶可以催化逆转录过程的发生，即催化脱氧核糖核苷酸以RNA为模板合成DNA，之后形成一代又一代的DNA，之后HBV双链DNA进行环化，最终完成HBVDNA的复制[9]，所以基于HBV逆转录酶的作用机制，笔者以HBV逆转录酶为作用靶点，进行抗乙肝病毒药物研发具有重要意义。

HepG2215细胞是将含有HBV基因组的重组载体质粒转染肝癌HepG2细胞[10]，经G418筛选得到的克隆，该细胞能在体外长期培养，并能稳定分泌HBsAg，HBeAg及Dane颗粒并产生cccDNA，是目前抗乙肝药物体外评价最常用的模型[11]；ROS是由细胞内氧代谢过程中产生的具有很高生物活性的氧分子[12]。这些氧分子主要由超羟自由基（・OH）、氧阴离子自由基（O-・2）、过氧化氢（H2O2）和单线态氧（O2）等氧自由基组成[13]。这些氧分子能够在机体内与自身的消化达到动态平衡，一旦平衡被打破，ROS将促进细胞的快速凋亡[1415]，本研究考察了不同浓度的丹参素对细胞内ROS的影响，发现丹参素可以诱导细胞内ROS水平的上升，进而诱导了HepG2215细胞的凋亡。此外，研究表明，丹参素能够促进HepG2215细胞活性的降低，且能够显著的抑制HBsAg，HBeAg的表达和HBV DNA的复制。这意味着，丹参素在细胞水平对HBV抗原的表达和DNA的复制起到抑制作用。

药物分子与蛋白的结合势必会对蛋白的结构造成影响，因此本研究应用了圆二色谱技术，圆二色谱技术以其较高的灵敏度、较好的选择性、较强的信号水平为酶（蛋白质）的二级结构测定提供了一条新的分析途径。结果表明，丹参素能够诱导HBV逆转录酶的α螺旋含量的增加，使HBV逆转录酶的结构变得紧密而不利于酶形成活性中心，致使HBV逆转录酶的活力下降[16]，这可能是丹参素对HBV逆转录酶活性抑制的机制。

[参考文献]

[1]李骅，王四旺，张邦乐. 丹参素的药理活性与药物动力学研究进展[J]. 西北药学杂志，2011，26（4）： 310.

[2]王冰瑶，吴晓燕，樊官伟. 丹参素保护心血管系统的药理作用机制研究进展[J]. 中药材，2014，45（17）： 2571.

[3]蒋莉，李跃华，戚晓红，等.丹素对内毒素性肝损伤的防护作用及其机制[J]. 西医结合肝病杂志，1999，9（2）： 30.

[4]郑元义，戴立里，王文兵，等. 丹参素治疗肝纤维化及其作用机制研究[J]. 中华肝脏病杂志，2003，11（5）： 288.

[5]黄正明，杨新波，曹文斌，等. 5种中药提取物对鸭乙型肝炎病毒逆转录酶和DNA聚合酶的抑制作用[J]. 人民军医药学专刊，1997，13（2）： 71.

[6]Fabrizio A，Alice F. Liposomes and MTT cell viability assay： an incompatible affair[J]. Toxicol In Vitro，2015，29（2）： 314.

[7]刘欣，索智敏. 苦参抗乙肝病毒的作用机制研究[J]. 中国生化药物杂志，2015，35（4）： 67.

[8]戴灵豪，沈钰明，伍义行，等. 松果菊苷对乙肝病毒复制和抗原表达的影响[J]. 中国中药杂志，2015，40（15）： 3047.

[9]张晨. 大黄酸联合贺普丁对乙肝病毒逆转录酶影响[J]. 中国公共卫生，2015，31（6）： 781.

[10]Seeger C， Mason W S. Hepatitis B virus biology[J]. Microbiol Mol Biol Rev， 2000， 64（1）： 51.

[11]Korba B E， Milman G. A cell culture assay for compounds which inhibit hepatitis B virus replication[J]. Antiviral Res， 1991， 15（3）： 217.

[12]刘仪，王凯，王介非. 氧化应激诱导细胞凋亡的机制[J]. 中华临床感染病杂志，2008，1（3）： 123.

[13]Shoeb M， Khan J A， Khan W， et al. ROSdependent anticandidal activity of zinc oxide nanoparticles synthesized by using egg albumen as a biotemplate[J]. Advan Nat Sci Nanos Nano， 2013， 4（3）： 35015.

[14]Pan X， Zhang X， Sun H， et al. Autophagy inhibition promotes 5fluorouraciinduced apoptosis by stimulating ROS formation in human nonsmall cell lung cancer A549 cells[J]. PLoS ONE， 2013， 8（2）： 55674.

[15]Sepúlveda M， Gonano L A， Back T G， et al. Role of CaMKII and ROS in rapid pacinginduced apoptosis[J]. J Mol Cell Cardio， 2013， 63（1）： 135.

[16]Yan J K， Zhang G W， Pan J H， et al. αGlucosidase inhibition by luteolin： kinetics， interaction and molecular docking[J]. Int J Biol Macromol， 2014， 64（3）：213.