利用全自动微波组织处理机快速完成透射电镜样品制备

时间:2022-09-23 10:33:50

利用全自动微波组织处理机快速完成透射电镜样品制备

摘 要 透射电镜在生命科学研究和临床诊断中发挥着重大作用,然而常规制样通常需要4至6天,严重限制透射电镜在快速检测中的应用。本文利用Leica全自动微波组织处理机快速处理生物样品,成功将制样时间缩短至6小时。电镜观察结果显示细胞结构保存完好,成像清晰。本研究表明利用全自动微波组织处理机能够实现生物组织的快速透射电镜样品制备。

关键词 透射电镜 微波 快速制样

透射电子显微镜生物制样是一个复杂的过程,需要经过固定、脱水、浸透和聚合等一系列步骤,手工操作过程繁琐、耗时较长,质控难度较大[1],在应对重大疫情和临床快速诊断应用中受到极大的限制。EM AMW是Leica公司推出的全自动微波组织处理机,利用微波加速组织固定、脱水和聚合的速度,能有效缩短组织制样时间。本文利用全自动微波组织处理机对Hela细胞、小鼠肺、胃、胰腺等组织进行样品制备,并与常规制备方法进行比较。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

宫颈癌细胞Hela;健康成年小鼠;环氧树脂Epon812;Leica EM AMW全自动微波组织处理机(德国Leica);H-7650透射电子显微镜(日本Hitachi);EM UC7超薄切片机(德国Leica)。

1.2 方法

选用健康成年小鼠,断头处死,迅速剖腹取胃、肺、胰腺组织,分别加入3%戊二醛4℃固定2h。Hela细胞1000转/min,离心10min,去上清后加入3%戊二醛4℃固定2h。固定后PBS清洗2次,每次10min。1%锇酸4℃后固定2h。以上样品分为微波组和常规组,微波组采用全自动微波组织处理机处理,对照组常规制样,制样步骤(见表1)。聚合后修块机修块,超薄切片机切片,醋酸铀和柠檬酸铅双染,透射电镜观察。

2 结果

2.1样品制备时间

微波组完成聚合耗时约3h,对照组耗时约62h,全自动微波组织处理机将脱水、浸透和聚合的时间缩短59h,仅花费常规方法二十分之一的时间。

2.2 样品透射电镜结果

常规组和微波组制备的Hela细胞、小鼠肺、胃、胰腺组织细胞样品透射电镜结果(见图1)。

微波组细胞膜结构保存较好,未见明显的细胞肿胀。胞质内含有丰富的细胞器,线粒体无肿胀,脊清晰(图1B),细胞核结构清楚,核膜清晰,核孔明显(图1D),胃底腺壁细胞内含有丰富的滑面内质网(图1F),胰岛细胞可见包膜清晰的胰岛分泌颗粒(图1H)。全自动微波组织处理机制样组的细胞超微结构清晰,未见明显的线粒体空泡化、内质网扩张等损伤情况。

3 讨论

微波是一种波长在1m到1mm之间的电磁波,生物组织在微波照射下,各种极性分子和离子在微波场的作用下高速运动,提高扩散速率[2],因此在电镜生物制样中,利用微波可以加速试剂与组织的相互作用,提高固定、脱水、浸透[3]和聚合的效率,缩短制样周期[4]。

Leica EM AMW能够全自动处理透射电镜生物样品,具有以下几个优点:(1)组织细胞结构保存较好,超微结构清晰;(2)节省时间,能够极大地缩短常规制样的时间,特别是在临床诊断中具有重大应用价值;(3)全自动处理样品,取材后几乎无需人工操作;(4)程序设置灵活,可以通过软件设置不同的参数组合,包括制样程序、时间、温度、加热模式和微波功率大小等。

利用EM AMW进行快速样品制备已有文献报道[5],与其不同的是,本实验没有利用EM AMW进行组织的戊二醛和锇酸固定,这主要是基于以下几点因素。首先,培养细胞等细胞样品,未经固定时细胞无法保持团块形态,利用EM AMW固定很容易冲散细胞,无法制样;其次,这2种固定液均有毒性,特别是锇酸毒性大、挥发性强,采用EM AMW固定需要良好的通风条件,否则极易发生事故;最后,锇酸价格昂贵,仪器使用的样品杯直径较大,试剂消耗量较大,经济性较差。另外,常规固定需时约4.5h较EM AMW固定多花费3h,节约时间并不明显,并不影响微波组在1天之内完成制样。

本实验方法将常规制样方法与仪器自带的程序相结合,极大地缩短制样周期,从取材开始至超薄切片染色后上机观察,可实现一个工作日内完成分析,且组织细胞结构保存完好,超微结构清晰,在重大应急反应及临床快速诊断中能够发挥重大作用。在使用过程中,我们曾经使用3种厂家推荐的聚合程序,包括常规聚合、快速聚合和温和聚合3种,结果表明,快速聚合的部分样品块较软,无法直接切片,温和聚合和常规聚合的样品块软硬适宜,可以直接制备超薄切片。

参考文献

[1] 林如辉, 黄美雅, 陈文列, 等. 透射电镜EMTP组织处理仪制样方法[J]. 临床与实验病理学杂志 2009, 25(4):445-446.

[2] 刘旭明, 王萍, 唐新萍, 等. 快速电镜制样技术在诊断电镜中的应用[J]. 临床试验病理学杂志, 1999, 15(1): 89.

[3] 刘庆宏,何幼英. 透射电镜快速制样在临床超微诊断中的应用[J]. 中国误诊学杂志,2011,11( 28) :6838.

[4] 张彰. 微波在电镜样品制备中的应用[J]. 山西医科大学学报, 2002, 33( 1):82.

[5] 周竞贤,郭晨. 利用微波组织处理机快速制备透射电镜样品的方法探讨[J]. 临床试验病理学杂志, 2013, 29(2):220-221.

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