共振光散射技术药物使用

【摘要】对共振光散射技术在药物与生物大分子分析测定中的应用状况及其进展进行了综述。重点介绍了该方法在生物体液中药物的分析和中药成分的分析应用前景。为体内大分子药物及其他药物成分的检测方法研究提供了新途径。

【关键词】共振光散射技术;药物分析

共振光散射(resonancelightscattering，RLS)是利用普通荧光分光光度法对散射光进行测量的一种散射光分析技术[1]。该技术由于其简单、快速、灵敏的分析特点，吸引了生命科学、分析化学、环境科学、材料科学等领域的分析工作者对其理论和应用进行了深入的研究，促进了分析学科内部各个分支之间的联系，尤其是在生化领域已经取得一定的研究成果[2]。

光散射现象广泛存在于光与粒子相互作用的过程中，当介质中粒子的直径(d)与入射光波长(λ0)存在d≤0.05λ0时，产生的是以瑞利(Rayleigh)散射为主的分子散射光[3]。根据RLS理论可以得到散射光强度与散射粒子的浓度c成正比的关系，即IRLS=Kcb。据此可以用于大分子物质溶液的分析测定[1]。

RLS分析法灵敏度高，操作简单方便，可通过普通荧光分光光度计同步扫描得到完整的RLS特征光谱和相应RLS峰。由于RLS法源于Rayleigh散射光吸收光谱，它对分子结构大小和形状(如球形、链形、无规则线团等)、电荷分布、键合性质等研究还能提供新的、更丰富的信息。近年来的研究证明，RLS法还可用于痕量金属、表面活性剂以及纳米材料[4,5]等方面的研究测定。该方法一般不需要对样品进行复杂的化学预处理，避免了一系列烦琐的操作程序，而直接将处理好的样品溶液置于普通的荧光分光光度计中进行测定即可。

1体液中生物大分子的测定

1.1蛋白质

蛋白质的功能很多，与生命的起源和生物的进化、细胞结构、病毒、免疫、酶、激素、物质的遗传等有密切的联系，它是生命现象的物质基础。蛋白质定量测定是生物化学和生命学科中经常涉及的分析内容，在临床医学中也有重要应用。目前，蛋白质测定方法主要有Lowry法[6]，Bradford法[7]，Biuret法[8]，BromoeersolGreen法[9]与Bormophenolblue法[10]等。Pasetmack[1]将RLS技术用于测定微量蛋白质以来，RLS法分析技术以其方法简单、快速、灵敏度高，在生物大分子分析测定研究中的报道日益增多，灵敏度可达纳克级[11]。

黄承志等研究了阴离子表面活性剂罗丹明B(RhodamineB，RhB)与十二烷基硫酸钠(SDS)?驳鞍字侍逑档?RLS光谱特征。实验发现，SDS与HSA(humanserumalbumin，HSA)结合后再与RhB作用，其散射光强度增强。且RLS增强的程度与蛋白的浓度在一定范围内呈线性关系。据此，建立了一种测定人血清中总蛋白质的新方法[12]。胡之德等基于在pH2.11的酸性溶液中，聚乙二醇辛基苯基醚(OP)对亮丽春红5R?驳鞍字侍逑档?RLS信号有强烈的增敏现象，建立了OP?驳鞍字湿擦晾龃汉?5R三元体系测定人血清中蛋白质浓度的新方法。该体系对人血清白蛋白检测的线性范围在0.0～10.0pg?mL-1之间，检测限为5.0ng?mL-1，检测实际样品的回收率在97.80%～109.62%之间，方法令人满意[13]。王锡宁等利用RLS技术测定白蛋白、红蛋白。研究了间苯二酚黄??OP?驳鞍字侍逑?RLS光谱特性，确定了在340.0nm处，pH2.40，间苯二酚黄浓度为2.3×10-5mol?L-1，OP的浓度为3.0×10-5mol?L-1时为最佳反应条件，据此建立了一种灵敏度高的测定蛋白质的新方法[14]。薛蓓等研究了流动注射(FIA)??RLS技术联用在线测定人血清中蛋白质含量。以SDS为荧光探针，利用未曾报道过的RLS与FIA联用检测人血清样品中蛋白质含量。与单纯用RLS法测定比较，分析时间由40min缩短至1min，RLS信号的重现性得到了显著改善，提高了实验的灵敏度和重现性[15]。梁宏等在普通荧光分光光度计上选择合适的激发光和发射光通带宽度，利用RLS技术，研究了生理pH值(7.43±0.02)，25℃下，金(Ⅲ)与血清白蛋白的相互作用。首次观测到金(Ⅲ)对血清白蛋白的RLS强度随着金(Ⅲ)浓度增加而降低。结果表明，金(Ⅲ)与血清白蛋白的结合会破坏血清白蛋白分子聚集，使血清白蛋白中的二硫桥键断裂，导致白蛋白分子趋于松散，散射截面积减小，表现为RLS强度降低[16]。

1.2核酸

核酸是遗传信息的载体和基因表达的物质基础，在生物的生长、发育等活动中具有十分重要的作用。目前核酸分析测定的方法主要有分光光度法、荧光光度法、化学发光法、探针技术法、免疫分析法等，其中分光光度法[17]和荧光光度法[18]使用较多。紫外分光光度法操作简单，但由于灵敏度低，测定的干扰因素多，使其在应用上受到了限制;荧光分析法具有选择性好和灵敏度高，但荧光试剂价格昂贵，而且部分荧光试剂有致癌活性。针对上述情况，RLS法因操作简便快速，灵敏度高，试剂无毒性等优势，在核酸分析中也得到了广泛的应用。

黄承志等利用溴化十六烷基三甲铵(cetyltrime??thylammonsiumbromide,CTMAB)是阳离子表面活性剂，核酸因带有大量的磷酸根而带负电荷的特性，证明了CTMAB和核酸通过静电引力共吸附到液/液界面上形成两性复合物，导致强烈增加的全内反射共振光散射(totalinternalreflectedresonancelightscattering，TIR??RLS)信号，TIR??RLS信号强度与核酸的浓度呈线性[19]。刘绍璞等研究了5种阳离子表面活性剂与核酸反应的RLS光谱[20]。陈展光等首次利用诺氟沙星做为RLS光谱探针，测定了叶绿体脱氧核糖核酸(ctDNA)。在pH5.87的BR(Britton??Robinson)缓冲溶液中，波长405.5nm处出现最大RLS峰，ctDNA的线性响应范围为0.02～2.30μg?mL-1，检测限为1.2ng?mL-1。还合成了希夫碱试剂三??(2??(邻羟基苯基亚甲氨基)乙基)胺，并且研究了其与核酸在盐酸介质中的反应。对希夫碱剂三??(2??(邻羟基苯基亚甲氨基)乙基)胺??DNA体系的研究发现，在393.0nm处增加的RLS强度与核酸的浓度成线性关系(ctDNA，0.01～4.50μg?mL-1;fsDNA，0.01～5.00μg?mL-1)。ctDNA的检测限是1.4ng?mL-1，fsDNA的检测限是2.1ng?mL-1。结果与紫外?部杉?分光光度法测得结果一致[21]。林枫等研究在pH4.0介质中加入DNA和阳离子表面活性剂可使二甲酚橙的RLS增强，据此建立了以二甲酚橙为分子探针测定DNA的分析方法，适用于合成样品中的DNA测定[22]。

2在化学药分析中的应用

黄承志等利用具有双亲性的RhB??CTMAB全内反射共振光散射法测定肝素，肝素通过与RhB和CTMAB相互作用形成三元双亲性的复合物RhB?哺嗡鬲?CTMAB，而被RhB和CTMAB协同吸附在水/四氯化碳(H2O/CCl4)界面上，引起强烈的TIR??RLS增强信号用于肝素的测定[19]。陈展光等在氧氟沙星?曹缢刈?3B体系中发现，pH5.09的BR缓冲溶液中，在439.5nm处，0.10～2.50μg?mL-1范围内的氧氟沙星与增加的RLS强度成线性关系。与此同时，在pH6.90，405.0nm处，0.05～3.00μg?mL-1范围内的氧氟沙星与RLS强度成线性关系，检测限分别为0.013μg?mL-1，0.021μg?mL-1[21]。氧氟沙星?曹缢刈?3B体系可用于人体的氧氟沙星血药浓度测定。还建立了人血清中抗菌类四季铵化合物的RLS技术检测方法[23]。陈展光等，建立的二溴羟基苯基荧光酮(DBHPF)?睬?通(Triton)X??100?差獾墓舱窆馍⑸涔馄仔绿逑担?分析测定了中药、头发以及水中的微量钼[21]。刘云富等研究发现在硫酸介质中，砷钼杂多酸与碱性染料RhB缔合导致RhB体系的RLS强度减弱，在一定浓度范围内，砷(Ⅴ)的含量与体系减弱的RLS强度成线性关系，据此建立了RLS技术测定砷(Ⅴ)的新方法[24]。

3在中药分析中的应用

黄承志等，研究了荧光素(Flu)?残￠藜?(BE)全内反射共振光散射法测定小檗碱。采用TIR??RLS技术通过Flu与BE在水/1,2,二氯乙烷(H2O/DCE)界面反应研究了BE在界面上的特性。Flu与BE形成双亲性的复合物，在H2O/DCE界面富集，并引起强烈增加的TIR??RLS信号，最大吸收波长位于373.0nm，所得信号强度在一定范围内与BE浓度成正比关系，检测限为1.3ng?mL-1。本方法与药典使用的HPLC方法对照灵敏度有所提高[19]。张忆华等，在pH为10.0的Tris缓冲溶液中建立了绿原酸??CTMAB??ctDNA体系，实验表明，440.0nm处增强的RLS光强度(ΔIRLS)稳定，在0.002～0.10μg?mL-1的浓度范围内，体系ΔIRLS与ctDNA的浓度具有良好的线性关系，检测限为0.6ng?mL-1。在厚朴酚??CTMAB??ctDNA体系中，选择pH值为10.0的Tris缓冲溶液来控制反应体系的酸度，356.0nm作为定量分析的波长。在0.02～1.00μg?mL-1的浓度范围内，ΔIRLS与ctDNA的浓度具有良好的线性关系。在最佳反应条件，320.0nm处，pH10.0时，儿茶素??CTMAB??ctDNA体系在0.02～1.00μg?mL-1的浓度范围内，ΔIRLS与ctDNA的浓度成线性关系。类似的实验还有山柰酚??CTMAB??ctDNA体系。此外，张忆华还研究了三价稀土离子与槲皮素、山柰酚所形成的络合物的RLS光谱，研究了ctDNA对它的淬灭作用。建立了Tb3+/Eu3+?查纹に鬲?ctDNA体系以及Tb3+/Eu3+?采借头营?ctDNA体系，结果表明，槲皮素与山柰酚通过配位作用与Tb3+/Eu3+结合，引起体系RLS光强度的增加，而当加入ctDNA后，体系的RLS光强度降低，原因是ctDNA结构中的磷酸骨架可以与Tb3+和Eu3+发生螯合作用，导致溶液中ctDNA和山柰酚与Tb3+/Eu3+的竞争配位。该方法取得了明显的实验成果[25]。新晨

4结语

由于RLS技术是建立在普通光谱法基础上，分析结果虽然是物质的散射光谱信息，但物质形态特征等却不能被获取。基于此问题，一种结合显微成像技术的共振光散射成像技术被建立起来，对生物大分子的聚集形态进行了深入的研究和探讨[26]，仪器的性能和工作条件对所获信号影响大。由于RLS光谱在较大光谱通带下获得，因而不利于光谱精细结构的研究。虽然我们知道散射光强度与散射粒子浓度有关，但出发点是从同步光谱开始的，显然其测定公式推导并未涉及RLS的散射本质。因此，用于分析化学的RLS技术原理与定量基础尚未有定论。虽然RLS技术作为一种新兴的分析测定技术存在一些不足，但随着RLS技术理论和应用上研究的深入，使RLS技术不断朝着痕量、高效、微观和自动化方向发展，极大地提高了RLS技术分析法的灵敏度，选择性和特异性，应用领域不断扩大。已报道的有关药物的RLS分析方法主要涉及如下药物：肝素[27]、地喹氯铵[23]、盐酸小檗碱[28]、多糖[29]、芦丁[30]、氨基糖苷抗生素[31]、青霉素[32]等。除了一些常规的测定药物的RLS方法之外，近几年还发展了以下几种方法[12]：RLS成像技术、FIA??RLS技术、双波长比率RLS技术等。RLS技术以其更灵敏、更方便，不需要荧光物质的特定体系等优势，必将更好地为药物分析测试服务。

【参考文献】

[1]PASTERNACKRF,COLLINGSPJ.Resonancelightscattering:Anewtechniqueforstudyingchromophoreaggregation[J].Science,1995,269:935-939.

[2]HUANGCZ,LIKA,TONGSY.Determinationofnucleicacidsbyaresonancelight??scatteringtechniquewithα,β,γ,δ??tetrakis[4??(trimethylammoniumyl)phenyl]porphine[J].Anal.Chemistry,1996,68:2259-2263.

[3]HUANGCZ,LIYF.Resonancelightscatteringtechniqueusedforbiochemicalandpharmaceuticalanalysis[J].AnalChimActa,2003,500(1-2):105-117.