胸腺素β4对重症急性胰腺炎大鼠的保护作用

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.10.004

基金项目：国家自然科学基金（81300356、81370562）

通信作者：王卫星，Email：

【摘要】目的 探讨胸腺素β4腹腔注射给药对重症性胰腺炎大鼠的保护作用及机制。方法 雄性SD大鼠54只，随机（随机数字法）分为3组：假手术组（SO组）、重症急性胰腺炎组（SAP组）、胸腺素β4预处理组（Tβ4组），每组18只。采用5%牛磺胆酸钠逆行胆胰管注射制备大鼠SAP模型，Tβ4组在造模前30 min经腹腔注射胸腺素β4（6 mg/kg），术后3、6、12 h分批剖杀大鼠，各时间点6只。检测血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β及IL-6水平，光镜观察胰头部组织病理变化，Western blot检测胰腺组织NF-κB p65和IκB α蛋白表达水平。多个样本均数比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。结果 SAP组（3、6、12 h）血清淀粉酶分别为（3221±394）U/L、（4509±474）U/L和（6280±728）U/L，高于相应时间点Tβ4组的（2598±416）U/L、（3639±373）U/L和（4782±466）U/L，差异具有统计学意义（t=-2.666，-3.530，-4.245，P

【关键词】急腹症；胰腺炎；胸腺素β4；肿瘤坏死因子-α；细胞信号通路；核因子-κB；肌动蛋白；全身炎症反应综合征；多器官功能不全综合征

Protective effect of thymosin β4 on severe acute pancreatitis in rats He Xiaobo， Wang Weixing， Liu Liming， Yu Jia， Zuo Teng， Shi Qiao， Guo Wenyi. Department of Hepatobiliary and Laparoscopic Surgery， Renmin Hospital of Wuhan University， Wuhan 430060， China

Corresponding author： Wang Weixing， Email：

【Abstract】Objective To investigate the protective effects and mechanisms of intraperitoneal administration of thymosin β4 on severe acute pancreatitis in rats.Methods Fifty-four male Sprague-Dawley rats were randomly（random number） divided into sham operation （SO） group， severe acute pancreatitis （SAP） group and thymosin β4 （Tβ4） pretreatment group （n=18 in each group）. SAP rat model was prepared by retrograde injection of 5% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct. Rats in Tβ4 group were treated with thymosin β4 （6 mg/kg） by intraperitoneal administration prior to SAP modeling. Six rats in each group were sacrificed at 3， 6， 12 hours， respectively after modeling. The serum levels of amylase， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， and interleukin-6 （IL-6） were detected， and pathological scores of the tissue of pancreas head were evaluated under light microscope. Pancreatic nuclear factor-kappa B （NF-κB） p65 and IκB α levels were detected by the Western blot. All data were analyzed by using the analysis of variance or t test.Results The levels of serum amylase of SAP 3， 6 and 12 hours groups were （ 3221±394） U/L， （ 4509±474） U/L and （ 6280±728） U/L， which were significantly higher than （ 2598±416） U/L， （ 3639±373） U/L and （ 4782±466） U/L of the Tβ4 groups （ t=-2.666， -3.530， -4.245， P

【Key words】Acute abdomen； Pancreatitis； Thymosin β4； Tumor necrosis factor-α； Cell Signaling Pathway； Nuclear factor-kappa B； Actin； Systemic inflammatory response syndrome； Multiple organ dysfunction syndrome

急性胰腺炎（acute pancreatitis， AP）是外科常见的急腹症，绝大多数患者病情较轻，但有约20%患者会发展为重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis， SAP），病情凶险，病死率高[1]。

SAP的发生会激活炎症细胞释放多种细胞因子，出现全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome， SIRS），波及全身多个组织器官，最终导致多器官功能不全综合征（multiple organ dysfunction syndrome， MODS），MODS是导致SAP患者死亡的主要原因[2-5]。

胸腺素β4（thymosin β4， Tβ4）是机体内的一个小分子多肽，普遍存在于哺乳动物的真核细胞中，是人体内主要的肌动蛋白调节分子之一。近年来研究证实，胸腺素β4在炎症调节、细胞凋亡、创伤愈合及组织再生等病理、生理过程中扮演着极为重要的角色[6]。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠54只，体质量180～220 g，由武汉大学动物实验中心提供。异氟烷购自上海雅培制药有限公司。牛磺胆酸钠购自美国Sigma公司，临用前以生理盐水配制。胸腺素β4购自吉尔生化（上海）有限公司，临用前以生理盐水配制。Elisa试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司。细胞白与细胞浆蛋白抽提试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。兔抗大鼠IκB α抗体与Lamin B1购自美国Santa Cruz公司。兔抗大鼠NF-κB p65抗体与β-肌动蛋白抗体均购自Cell Signaling Technology公司。ECL发光显色试剂盒购自Millipore公司。

1.2 动物分组与处理

将所有大鼠随机（随机数字法）分为3组，即假手术组（SO组）、重症急性胰腺炎组（SAP组）和胸腺素β4处理组（Tβ4组）。所有大鼠术前禁食12 h，自由饮水，采用吸入性异氟烷对SD大鼠进行诱导（质量分数5%）和维持麻醉（质量分数2%），消毒皮肤后正中切口入腹，SO组大鼠开腹后翻动十二指肠及胰腺后随即关腹；SAP组大鼠经胆胰管逆行缓慢匀速（0.1 mL/min）注入5%牛磺胆酸钠（0.1 mL/100 g）制备SAP模型；Tβ4组大鼠在造模前半小时经腹腔注射胸腺素β4（6 mg/kg）[7]。各组大鼠于术后3、6、12 h分批处死。下腔静脉穿刺采血，1500 r/min离心15 min，分离血清，置于-80℃保存备用，取少许胰头部胰腺组织，用4%多聚甲醛固定，用于组织形态学检查。另取部分胰腺组织迅速置入液氮中再转入-80℃冰箱保存备用。

1.3 血清淀粉酶检测

采用武汉大学人民医院全自动生化分析仪测定各组大鼠血清淀粉酶的水平。

1.4 胰腺病理学检查

将固定好的胰腺组织进行常规石蜡包埋、切片、HE染色，然后在光镜下进行观察，并按Schmidt等[8]方法对胰腺组织进行病理评分。

1.5 血清TNF-α、IL-1β、IL-6的检测

采用Elisa法检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β与IL-6的含量。

1.6 Western blot检测

NF-κB p65和IκB α蛋白水平：取各组12 h时间点大鼠胰腺组织进行匀浆，抽提白与浆蛋白，然后进行蛋白定量，最后行Western blot检测NF-κB p65和IκB α蛋白表达水平。兔抗大鼠IκB α抗体、NF-κB p65抗体、Lamin B1抗体、β-肌动蛋白抗体工作浓度分别为1∶500、1∶1000、1∶1000、1∶1000。ECL试剂盒显影，凝胶成像系统行条带灰度扫描，两者分别以Lamin B1和β-肌动蛋白作为内参。。

1.7 统计学方法

应用统计学软件SPSS 16.0进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（ x±s）表示，两组间的比较采用成组t检验，多组间的比较采用单因素方差分析，以P

2 结果

2.1 血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β及IL-6水平变化

SAP组血清淀粉酶水平随着时间的延长逐渐升高（F=46.660， P

2.2 胰腺组织病理学变化

SO组各时间点胰腺组织均未见明显病理改变。SAP组各时间点胰腺组织均可见不同程度的腺泡水肿、间质出血及片状坏死，并伴有大量的炎性细胞浸润，其病理评分随着时间延长逐渐增加（F=53.338， P

2.3 胰腺组织NF-κB p65和IκB α蛋白表达

SO组12 h时间点胰腺组织NF-κB p65蛋白相对表达量为（0.95±0.11），显著低于SAP组12 h时间点的（2.40±0.17），差异具有统计学意义（t=-17.368， P

3 讨论

重症急性胰腺炎的发病机制至今尚未完全阐明，众多研究显示，NF-κB信号通路的活化以及多种细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的产生在SAP的发生发展过程中起着极为重要的作用[2， 9]。TNF-α是急性胰腺炎病程中关键的炎症因子，它可在发病短时间内迅速升高，并且能活化NF-κB等炎症信号通路，诱导IL-1β、IL-6、IL-8等细胞因子的产生，这些因子相互影响，激发一系列连锁和放大效应的级联反应[9-11]。因此，抑制NF-κB信号通路的活化和降低炎症细胞因子在治疗重症急性胰腺炎的过程中逐渐受到重视。

胸腺素β4在人体组织和细胞广泛存在，其中在血小板、巨噬细胞及白细胞中含量较高[12]。目前有研究证实，在内毒素诱导的感染性休克模型中，胸腺素β4能够抑制大量炎症介质的产生，并能减少炎症细胞的浸润以及降低病死率[13]。本研究结果显示，SAP组大鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β和IL-6随着病程的延长逐渐升高，12 h达到高峰，组织病理学可见胰腺水肿、出血及片状坏死，伴有炎性细胞浸润，胰腺病理评分升高明显，其水平较SO组显著升高。而使用胸腺素β4后，血清淀粉酶和炎症细胞因子水平明显降低，胰腺坏死情况较SAP组相应时间点明显好转。这一结果证实了胸腺素β4能够减轻重症急性胰腺炎的胰腺坏死和炎性细胞浸润，下调炎症介质及细胞因子水平。

另有研究显示，胸腺素β4能够抑制因TNF-α所致的NF-κB信号通路的活化，可以调节角膜碱烧伤后炎症反应的程度[14]。Gupta等[15]研究报道证实胸腺素β4能够抑制实验诱导的小鼠心肌梗死模型中NF-κB的活化，减轻炎症反应，对保护心肌有一定的作用。本研究结果显示SAP造模成功后，大鼠胰腺组织NF-κB信号通路被激活，NF-κB p65蛋白表达升高，而IκB α蛋白表达降低。IκB是调控NF-κB的一个关键蛋白，NF-κB未被激活时和IκB形成一个复合物。在各种炎症细胞因子（如TNF-α等）刺激的情况下，胞浆中的IκB会被磷酸化，随后被降解，NF-κB的核定位序列就会暴露，从而被转运至细胞核内促进NF-κB依赖的基因转录，这会诱导产生更多的炎症细胞因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6等[9]。而TNF-α能直接促进蛋白酶提前被激活以及胰腺腺泡细胞坏死[16]。胸腺素β4干预组大鼠胰腺组织中NF-κB p65蛋白表达较SAP组降低，IκB α蛋白表达较SAP组升高，这提示胸腺素β4能够抑制胰腺组织NF-κB信号通路的活化，从而进一步降低炎症细胞因子的产生，说明胸腺素β4可能通过抑制炎症信号通路来减轻胰腺的炎症反应及坏死情况。

综上所述，胸腺素β4对SAP大鼠胰腺组织具有保护作用，其机制可能是通过抑制NF-κB信号通路和减少炎症因子的释放来实现的，这为临床治疗SAP提供了新的策略和方法。目前，胸腺素β4应用范围较广，目前已进入临床研究阶段，主要有角膜伤口愈合与修复、心肌梗死后心肌的保护、颅脑外伤后的中枢神经系统的保护等，均有较好的效果，并且有较高的安全性。但对重症急性胰腺炎的效果及确切的作用机制，尚需大量研究。

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（收稿日期：2014-06-02）

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