塞来昔布对前列腺癌细胞株PC?3中VEGF?C及bcl?2 mRNA表达的影响

【摘要】 目的 探讨环氧化酶?2(cox?2)选择性抑制剂塞来昔布(celecoxib)对前列腺癌细胞株pc?3 中vegf?c mrna及bcl?2 mrna表达的影响,研究cox?2抑制剂抗肿瘤的作用机制。方法 将培养的pc?3细胞分为四组：试验组(分别以10μmol/l、20μmol/l、40μmol/l不同浓度塞来昔布处理)和对照组，采用rt?pcr的方法检测四组中vegf?c及bcl?2 mrna的表达。结果 10μmol/l塞来昔布组vegf?c/gapdh值及bcl?2/gapdh值与对照组相比差别均无统计学意义(p＞0.05)；20μmol/l及40μmol/l塞来昔布组vegf?c/gapdh值分别为0.370±0.063、0.263±0.062，bcl?2/gapdh值分别为0.339±0.047、0.272±0.042，两组中上述两项指标均较对照组明显下降(p均＜0.01）。结论 塞来昔布可能通过对前列腺癌细胞株pc?3中vegf?c及bcl?2 mrna表达的抑制发挥其抗肿瘤作用。 【关键词】 前列腺癌 塞来昔布 血管内皮生长因 bcl?2

研究表明，环氧化酶?2（cox?2）在前列腺癌组织中表达增强[1，2]。体外实验证实cox?2抑制剂具有抑制前列腺癌细胞生长的作用[3,4]，但其抗肿瘤的机制尚不完全明确。本实验采用rt?pcr的方法对前列腺癌细胞株pc?3中的vegf?c及bcl?2 mrna进行检测，进而探讨cox?2选择性抑制剂塞来昔布(celecoxib)的抗癌机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株pc?3,由青岛大学医学院病理生理教研室惠赠。

1.2 主要试剂

选择性cox?2抑制剂塞来昔布购自普强苏州制药有限公司。rpmi 1640培养液、小牛血清均购自青岛海泰生物技术有限公司；总rna提取试剂盒，cdna合成试剂盒及pcr扩增试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.3 细胞培养及实验分组

将塞来昔布加入适量的0.01mol/l pbs(ph7.4)中配制成5.6mg/l母液，高压灭菌于4℃保存，使用时用培养液稀释成所需浓度；在含10%小牛血清的rpmi1640细胞培养基中加青霉素及链霉素各100u/ml，将pc?3细胞接种于配好的培养基中，在37℃、5%co2及95%饱和湿度条件下培养，每3～5天传代。取对数生长期的前列腺癌细胞进行实验，用质量分数0.25%的胰蛋白酶消化,加培养液制成5×105/ml细胞悬液，接种于96孔培养板，200μl/孔,待细胞贴壁后去上清，试验组分别加入含10、20、40μmol/l三种不同浓度的塞来昔布培养液,每一浓度设10个重复孔，对照组仅加入含10 %小牛血清的rpmi 1640培养液。继续培养72h后收集细胞，进行总rna提取及rt?pcr检测。

1.4 引物的设计与合成

采用primer5.0软件设计相关基因引物序列。bcl?2的引物序列为：上游引物5′?gtg gtg gag gag ctc ttc ag?3′，下游引物5′?tcc aca aag gca tcc ca g?3′，产物片段长203bp；vegf?c上下游的引物序列分别为：5′?aat gtg ggg cca acc gag aa?3′，5′?cca ata tga agg gac aca acg?3′，扩增长度为259bp；内对照3?磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)上下游引物分别为：5′?ggt gaa ggt cgg agt caa cgg?3′，5′?ggt gat gag tcc ttc cac gat?3′，扩增长度为425bp。以上引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.5 总rna 提取及rt?pcr

采用trizol一步法提取总rna。紫外分光光度计测样品a260和a280值, 琼脂糖凝胶电泳鉴定rna质量，其余-80℃保存。按逆转录试剂盒说明书操作反转录合成cdna，产物-20℃保存。取反转录产物5μl进行pcr扩增，反应体系为50μl，包括10×buffer 5μl，25mmol/l mgcl23μl，10mmol/l dntp 1μl，上下游引物各2.5μl，cdna模板5μl，taq酶1μl，ddh2o 30μl。vegf?c的反应条件为：94℃预变性1min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸40s，共35个循环，最后72℃延伸10min；bcl?2的反应条件：94℃预变性2min后，94℃45s，50℃退火40s，72℃60s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min；gapdh作为内参照基因与目的基因一一对应同时进行pcr反应，以达定量目的。pcr 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳eb染色观察结果。以平均吸光度×条带面积表示总的吸光度，以此代表mrna 的量。凝胶图像分析系统以vegf?c和bcl?2基因与内参照基因（gapdh）电泳带的吸光度比值作为vegf?c和bcl?2 mrna的表达量指标。

1.6 统计学方法

采用spss12.0统计软件进行单因素方差分析和两两比较q检验，数据均用±s表示。

2 结果

前列腺癌细胞pc?3中vegf?c及bcl?2 mrna表达的pcr产物凝胶电泳结果见图1、2。在三个处理组中，20μmol/l、40μmol/l塞来昔布组vegf?c和bcl?2mrna表达量均降低，尤以40μmol/l组降低明显。凝胶图像分析系统分析结果经统计软件处理，对照组与各处理组中vegf?c/gapdh及bcl?2/gapdh的值见表1、2。表明在一定浓度范围内，塞来昔布对pc?3细胞株中vegf?c及bcl?2 mrna的表达有抑制作用。表1 vegf?c mrna在pc?3中的表达 表2 bcl?2 mrna在pc?3中的表达

3 讨论

环氧化酶是前列腺素合成过程中的限速酶，有cox?1、cox?2和cox?3三种。自上世纪90年代cox?2抑制剂的抗肿瘤作用日益受到人们重视，动物实验也已证明选择性cox?2抑制剂可对肿瘤产生显著治疗作用［5］。cox?2抑制剂防治肿瘤的机制可能是通过抑制cox?2进而抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡。塞来昔布是近年来开发的新型非甾体类抗炎药,其抗肿瘤作用已有报道［6］,但其作用机制尚不完全清楚。据此，我们选择了vegf?c和bcl?2作为研究对象探讨cox?2抑制剂抗肿瘤的作用机制。

肿瘤的生长、浸润和转移是血管生成依赖性的，当肿瘤＞0.4mm3时，为保证其快速增殖，必须有血管生成［7］。提示血管内皮生成因子(vascular endothelial growth factor，vegf)与恶性肿瘤的发生及生长有一定关系。vegf?c是vegf家族成员之一，有较强的促进新生血管和淋巴管形成作用，参与病理性、生理性淋巴管和血管新生。已有实验表明，前列腺癌组织vegf?c mrna的表达，促进了肿瘤诱导的淋巴管新生，在前列腺癌的淋巴转移中发挥了重要作用［8］。cheng等［9］对肝癌组织中cox?2 、vegf、前列腺素( pg) 以及肿瘤微血管密度(mvd) 的状况进行了检测, 发现cox?2 和vegf 在肝细胞癌中的表达均有增高 ,且cox?2 与vegf及mvd有关(p=0.003和p=0.004)。在某些消化道肿瘤中cox?2表达与vegf呈正相关，提示cox?2可能通过诱导vegf表达上调促进肿瘤生长［10］。

bcl?2基因是从滤泡性淋巴细胞中分离出来的一种癌基因。在多种肿瘤中表达，具有抑制肿瘤细胞凋亡的作用［11］。bcl?2基因的过度表达并不影响细胞增殖和加速细胞分裂，而是阻止细胞凋亡的发生，延长肿瘤细胞生存时间［12］。在对某些皮肤肿瘤的研究中发现，bcl?2 的表达与cox? 2 的过表达有关，cox?2 可能是通过激活bcl?2 发挥抗凋亡作用而促进皮肤肿瘤形成及发展。

本实验证实了一定浓度的塞来昔布对前列腺癌细胞株pc?3中vegf?c及bcl?2 mrna的表达有抑制作用，表明cox?2抑制剂可能通过对前列腺癌细胞中vegf?c和bcl?2基因表达的抑制来发挥其抗肿瘤作用。这为临床上治疗前列腺癌，特别是非激素依赖型前列腺癌提供了新的方法。

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