DNA甲基化与个体年龄的相关性研究进展

【摘 要】年龄推断在法医实践中占有重要的地位。分子生物学的巨大进展使得人们借助于生物学标记推断个体年

龄成为可能。作为表观遗传学重要组成部分的dna甲基化，在机体生长、发育、衰老的过程中存在着动态变化过程．通过

检测dna甲基化改变，有望构建与之相关的年龄变化模式，用以推断个体年龄。本文着重介绍dna甲基化水平的改变与

个体年龄的相关性及其在判断个体年龄方面的前景。

【关键词】法医物证；dna甲基化；年龄推断；生物体衰老

【中图分类号】d9l9．2

【文献标识码】a

【文章编号】1007—9297(20__)04—0284—05

当前在法医学实践中，对个体年龄的推断主要是

依据人类学方法测量骨骼、牙齿等一些具有年龄相关

性的检材．并根据相关模型进行计算。分子生物学的

飞速发展，开拓了人们的视野。借助于分子生物学理

论和方法．在细胞水平、分子水平发现一些可能与年

龄相关的遗传学改变，如dna损伤修复能力、端粒的

长度、线粒体片段的缺失、dna甲基化水平、b一半乳糖

苷酶活性以及基因表达谱等。lll dna甲基化是表观遗

传学(epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞

功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重

要作用．在衰老的过程中某些细胞会发生年龄相关的

变化，121例如某个cpg岛的从头甲基化会关闭一个基

因，使这个基因相关的生理功能丧失：同样。甲基化的

丢失也会激活正常情况下沉默的基因．造成不恰当的

异位表达(ectopic expression)。必须指出，表观遗传研

究丝毫没有降低遗传学或基因组学的重要性，恰恰相

反，表观遗传学是在以孟德尔式遗传为理论基石的经

典遗传学和分子遗传学母体中孕育的专门研究基因功

能实现的一种特殊机制的遗传学分支学科。认识到表

观基因组在发育、生长和衰老过程中存在着一个动态

变化的过程，以及体细胞的表观基因组有重新编程的

可能性，有助于我们以新的观点来探索衰老的机制，构

建年龄变化的模式。本文就dna甲基化与个体年龄的

相关性及其在判断个体年龄方面的前景进行探讨。

一

、概述

(一)表观遗传学和dna甲基化

遗传学是与表观遗传学(genetic)相对应的概念。

遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变

化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等；而

表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表

达水平变化，如dna甲基化和染色质构象变化等：表

观基因组学(epigenomics)~0是在基因组水平上对表观

遗传学改变的研究。甲基化是最重要的表观遗传修饰

形式。dna甲基化是生物体在dna甲基化转移酶

(dnmts)的作用下，以s一腺苷酰一l一甲硫氨酸(sam)

为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上去的过程，

dna甲基化多发生在胞嘧啶，大多在一cpg一序列上。

胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine．

5-mc)。这种dna修饰方式并没有改变基因序列。但

它调控了基因的表达。

哺乳动物中．cpg序列在基因组中出现的频率仅

有l％，远低于基因组中的其他核苷酸序列。但在基因

组的某些区域中，cpg序列密度很高，可以达均值的5

倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区．形成所谓

cpg岛。通常cpg岛大约含有500多个碱基。在哺乳

动物基因组中约有4万个cpg岛，而且只有cpg岛

的胞嘧啶能够被甲基化，cpg岛通常位于基因的启动

子区或是第一个外显子区 。人类基因组中大小为

100～l 000 bp左右且富含cpg二核苷酸的cpg岛总

是处于未甲基化状态．并且与56％的人类基因组编码

基因相关。人类基因组序列草图分析结果表明，人类

基因组cpg岛约为45 000个．大部分染色体每1 mb

就有5—15个cpg岛。平均值为每mb含lo．5个cpg

岛，cpg岛的数目与基因密度有良好的对应关系。健

康人基因组中．cpg岛中的cpg位点通常是处于非甲

基化状态，而在cpg岛外的cpg位点则通常足甲基化的。这种

甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。阁基因

调控元件(如启动子)所含cpg岛中的5-mc会阻碍

[作者简介]李鑫(1974一)，男，山东淄博人，主检法医师，硕士研究生，主要从事法医遗传学研究。

法律与医学杂志20__年第l3卷(第4期)

转录因子复合体与dna的结合，所以dna甲基化一

般与基因沉默(gene silence)相关联；而去甲基化

(demethylation)往往与一个沉默基因的重新激活(re．

activation)相关联。当机体衰老或呈病理状态，特别是

肿瘤发生时，抑癌基因cpg岛以外的cpg序列非甲

基化程度增加，而cpg岛中的cpg则呈高度甲基化，

以至于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。

一般说来，dna的甲基化对维持染色体的结构、x染

色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的

作用。【6】

(二)dna甲基化的生物作用及特点

1．dna甲基化与基因表达

dna甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚

胎发育过程以及衰老过程中起着极其重要的作用。研

究表明胚胎的正常发育得益于基因组dna适当的甲

基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的

发育都是致死性的。[31此外，等位基因的抑制被印记控

制区(icrs)所调控，该区域在双亲中的一个等位基因

是甲基化的。17]印记基因的异常表达可以引发伴有突

变和表型缺陷的多种人类疾病。甲基化抑制基因转录

主要通过以下机制来实现。

(1)直接抑制。cpg岛甲基化真接干扰tf与调控

区dna 的结合． 例如camp反应元件结合蛋白

(creb)，ap一2，e2f，nfkb等tf不能与相应的dna

位点相结合。但有些tf如sp1，ctf与甲基化和非甲

基化位点都能结合，这表明甲基化单独不足以阻止体

内tf与dna相结合。

(2)间接机制。近年来发现一些甲基化dna结合

蛋白如mdbp1，mdb2以及甲基化cpg结合蛋白如

mecp1，mecp2与甲基化dna特异结合，抑制基因转

录。其介导转录抑制的程度取决于甲基化密度和启动

子的强度。如低密度甲基化可完全抑制一些弱的启动

子，但对强的启动子则收效甚微。

(3)dna甲基化还可通过影响染色体结构来抑制

转录。不仅甲基化启动子区形成的核小体抑制体外起

始转录，而且mecp1与甲基化启动子cpg位点结合

后，可引起染色质聚缩成非活性高级结构，以至于转

录因子不能与其相结合，从而抑制转录。

dna甲基化状态并非固定不变．在许多哺乳动物

组织内，基因组甲基脱氧胞嘧啶水平随老化而下降，

在鲑鱼、小鼠、大鼠、牛与人类的脑、肝脏、大肠粘膜、

心脏和脾脏内发现dna脱甲基化作用。相反，大鼠肺

则不发生脱甲基化，大鼠。肾内甲基脱氧胞苷总含量增

加。这说明甲基化状态随老化而变化，即发生甲基化

· 285 ·

和脱甲基化，但总的说来，最常见的变化似乎是进行

性的脱甲基化。这些变化均可导致随老化而发生的基

因表达变化。

2．dna甲基化与肿瘤的关系

研究表明，dna甲基化在肿瘤的发生、发展中起

重要作用。甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要

因素，这种变化包括dna甲基化总体水平降低和启

动子等基因表达调控元件附近的cpg岛局部甲基化

水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定(如染色

体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表

达)和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的

等位基因失活，则发生癌症的几率提高，例如：胰岛素

样生长因子一2(igf一2)基因印记丢失导致多种肿瘤，

如wilm‘s瘤。【8j

3．dna甲基化与基因印记

基因组印记是性细胞系的一种表观遗传修饰，这

种修饰有一整套分布于染色体不同部位的印记中心

来协调。印记中心直接介导了印记标记的建立及其在

发育全过程中的维持和传递，并导致以亲本来源特异

性方式优先表达两个亲本等位基因中的一个．而使另

一个沉默。基因组印记是可遗传的，dna的甲基化在

基因组印记的分子机理中充当重要角色。dna高甲基

化是一个基因印记抑制信号，dna甲基化对控制印记

基因中父子和母子等位基因的不同表达具有重要作

用。[91

4．人类基因组dna甲基化的特点

dna甲基化的基本特征有：1)数量多、信息容量

大；2)可遗传性：有丝分裂时分化细胞可以稳定地将

甲基化模式传递给子代细胞：3)相对稳定性，即在体

内．内外环境短时间变化不会引起细胞基因组甲基化

谱的改变；4)与snp标记毗邻，提供不同层次信息，相

互补充。人类基因组dna甲基化还有自身特点。

(1)时空特异性。dna甲基化是记录细胞分化历

史、维持组织特异性基因表达的主要机制之一。有学

者认为，dna甲基化可能使分化细胞基因组重新编

程，通过dna 甲基化来控制基因的时空表达，调节发

育过程和各种生理反应。在不同组织或同一类型细胞

的不同发育阶段，基因组dna上各cpg位点甲基化

状态的差异构成基因组dna甲基化谱。组织特异的

dna甲基化谱是哺乳动物基因组的一个显著特征。

细胞之间dna甲基化模式的差异是在个体发育

的过程中逐步形成的，并在以后的有丝分裂中保持不

变。在胚胎发育过程中，细胞的甲基化模式按一定方向

发生有规律地变化。成年个体，组织特异性基因形成组

· 286 ·

织特异性的甲基化模式。随着年龄增长，基因组dna甲

基化总体水平不断下降．特定dna片断的甲基化程度

可以增高或降低。取决于组织细胞和基因种类。

(2)亲缘特异性。在某些基因座，所有组织体细胞

都选择性地将亲代一方的等位基因甲基化．呈现亲缘

依赖的等位基因甲基化模式。

(3)病理特异性。在病理状态下，组织细胞的dna

甲基化谱发生特异性的改变。dna甲基化改变在许多

肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用。目前证实，启

动子高甲基化是肿瘤抑制基因第三种常见的失活途径。

二、dna甲基化与年龄相关性

分化细胞的稳定性是高等生物的基本特征之一。

然而，在衰老过程中某些细胞会发生年龄相关的变

化。例如，某种cpg岛的从头甲基化会关闭一个基因，

丧失与这个基因相关的生理功能；同样．甲基化的丧

失也会激活正常情况下沉默的基因，造成不恰当的异

位表达。2o世纪8o年代初，wilson等测定了体外培养

的人、田鼠及小鼠成纤维细胞dna的5 甲基胞嘧啶

含量，发现均随细胞分裂次数的增加而降低．且下降

速度以人、田鼠、小鼠的次序递减．而永生化细胞系的

5 甲基胞嘧啶含量则保持相对稳定。以dna甲基化

酶抑制剂5 氮杂胞苷或5 氮脱氧胞苷处理人二倍

体成纤维细胞或某些肿瘤细胞，可使其增殖能力下

降，体外培养寿限缩短。因此，dna甲基化水平也可以

作为细胞分裂的“计时器”。体内实验同样发现基因组

整体甲基化水平有随龄降低的趋势。

在基因组整体甲基化水平降低的同时，衰老过程

中也伴有个别基因甲基化水平增高的现象。最早证明

与年龄相关启动子cpg岛的甲基化是人结肠组织雌

激素受体(estrogen receptor，er)基因，年轻个体中，几

乎检测不到er基因的甲基化，以后，随龄逐渐升高。

另外。胰岛索样生长因子2(insulinlike growth facror，

igf2)、肌原调节蛋白myod1、体觉诱发电位组分

n33基因启动子cpg岛的甲基化水平在正常的结肠

组织中同样随龄升高。tra等用限制性界标基因组扫

描技术对t淋巴细胞20__个基因座的甲基化年龄变

化情况进行了调查，发现29个基因座有变化，其中23

个增加，6个降低。也许．这些特定基因的甲基化是更

好的衰老生物学标志。

陈培利等_10]利用人胚肺二倍体成纤维细胞(hu

man fetal lung diploid fibroblasts。2bs)进行体外培养。

发现其p16基因启动子区及外显子i处的dna甲基

化水平随个体细胞代龄的增加而降低。他们首先将

2bs细胞在体外作常规传代培养(规定3o代龄以内为

法律与医学杂志20__年第l3卷(第4期)

年轻细胞，55代龄以上为衰老细胞，在31至54代龄

之问位中年细胞)。然后用有机法提取细胞dna，取各

组dna各llxg加入sinai约40u，25~c酶切过夜(smai

不具备甲基化修饰作用)。然后对p16基因外显子i

及13-actin进行pcr扩增。

ll 二| ’。_ lll

l | _ __⋯一_l＼

‘l ＼_ _l’ _li ＼

_l＼ il 、

l i、

4 _ li 0_ _l

年轻细胞中年j田胞老年细胞

围1不同代龄2bs细胞p16外显于pcr扩增条带的吸光度扫描值【’。

寰1 不同代龄2bs细胞pl6外丑于l殛i~-actinpcr扩增条带的吸

光度扫描值

组别 n

沣：#以b—actin的值校正后结果；t检验，与年轻细胞相比， p<o．05

实验结果(参见表1)表明，不同代龄2bs细胞

p16基因外显子i上的扩增产物均低于相对的未酶切

的b—actin对照组，且其dna甲基化水平随代龄的增

加而趋于降低，在年轻细胞中甲基化水平约为64％．

而在衰老细胞中仅为24％，降低约40％。在之后的研

究中，陈培利等在以2bs为模型的衰老研究中发现，

细胞分裂一次端区(即端粒)缩短50bp，抑制dna甲

基化则可导致细胞早衰。⋯】他们测定了去甲基化处理

后的2bs细胞的端区长度．研究表明老年2bs细胞衰

老表型更加明显，端区长度较对照细胞缩短，而年轻

细胞则变化不显著。从而推断甲基化的改变可以影响

染色质的构象，从而可能改变端区结合蛋白与dna

的作用l1 1，后者可以进一步引起端区长度改变。

三、dna 甲基化检测方法

随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化

检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。

dna甲基化可以从甲基化含量、甲基化水平、甲基化

模式和甲基化图谱分析等多种途径进行分析。甲基化

含量分析5mc在基因组中所占的总体比例：甲基化水

2 1 8 6 4 2 0

l n n

璎辍 越

法律与医学杂志20__年第13卷(第4期)

平分析单个cpg胞嘧啶甲基化的发生率，若同时分析

多个cpg位点，则可以制作甲基化水平图谱；甲基化模

式分析一段单链dna上一组cpg的甲基化状态组合。

根据研究目的，甲基化检测方法分为：基因组整体水平

的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和寻找新甲基化

位点。从研究所用的处理方法不同分为：基于pcr的甲

基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；

基于重亚硫酸盐的分析方法和层析法等。[31以下归纳

总结了主要的甲基化分析方法以及相关特性。

(一)基因组整体水平甲基化分析

高效液相色谱柱(hplc)及相关方法。hplc是一

种比较传统的方法，能够定量测定基因组整体水平

dna甲基化水平。它由kuo等1980年[131首次报道。

过程是将dna样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，

水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光

测定吸收峰值及其量，计算5mc／(5mc+5c)的积分面

积就得到基因组整体的甲基化水平。oefner等1992

年提出变性高效液相色谱法(dhplc)用于分析单核

苷酸和dna分子。邓大君等20__年i141将其改进与

pcr联用建：立了一种检测甲基化程度的dhplc分析

方法。将重亚硫酸盐处理后的产物进行差异性扩增。

由于原甲基化的在重亚硫酸盐处理时仍被保留为胞

嘧啶，因此原甲基化的在pcr扩增时，其变性温度也

相应上升。使pcr产物在色谱柱中保留的时间明显延

长．这样就可以测定出pcr产物中甲基化的情况。

这种方法的最明显优点是：可用于高通量混合样

本检测．能够明确显示目的片段中所有cpg位点甲基

化的情况．但不能对甲基化的cpg位点进行定位。

其他基因组水平甲基化分析还有sssi甲基转移

酶法，免疫化学法，氯乙醛法等。各具优缺点。

(二)特异性位点的dna 甲基化的检测

1．甲基化敏感性限制性内切酶(ms—re—pcr／

southern)法

这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲

基化区的不切割的特性．将dna消化为不同大小的

片段后再进行分析。 这是一种经典的甲基化研究方

法，其优点是：相对简单，成本低廉，甲基化位点明确，

实验结果易解释；

2．甲基化特异性的pcr(ms—pcr)

herman等[161 1996年在使用重亚硫酸盐处理的基

础上新建的一种方法。它将dna先用重亚硫酸盐处

理。这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化

的不变。随后行引物特异性的pcr。检测msp扩增产

物．如果用针对处理后甲基化dna链的引物能扩增

· 287 ·

出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；若用针对

处理后的非甲基化dna链的引物扩增出片段．则说明

被检测的位点不存在甲基化(见图2)。[15·17]

． ／

5’衄_{2盈__ 平 盈3． 5-啪__曩墨|_唧h _霉叠__甲3·

— __． —

p1．m ri 一 一

图2甲基特异性的pcr扩增(ms—pcr)示意i莩i。dna经重亚硫酸盐处

理后。以处理后的产物作为模板．加入甲基化特异性的引物(primer 1)

或非甲基化的引物(primer¨)．进行特异性的扩增(如图所示)，只有结

合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物。[1s,1

(三)寻找新甲基化位点

1．限制性标记基因组扫描(rlgs)

costello等20__年报道的rlgs[ 81能对整个基因

组的甲基化状态进行分析．发现新甲基化基因的方

法。这种方法联合使用了限制性内切酶及二维电泳。

其过程是：先用甲基化敏感的稀频限制性内切酶not

i消化基因组dna，甲基化位点保留，标记末端、切

割、行一维电泳，随后再用更高频的甲基化不敏感的

内切酶切割。行二维电泳，这样甲基化的部分被切割

开并在电泳时显带，得到rlgs图谱与正常对照得出

缺失条带即为甲基化的可能部位。

2．联合甲基化敏感性限制性内切酶的mb(com．

pare—ms)

srinivasan yegnasubramaniant 91 20__年报道了一

种新方法compare—ms．该法将mbd柱层析法与

ms—re联用。互补了各自单用的弊处，能够快速、敏感

的检测dna甲基化情况(见图3)。[19j

四、甲基化型分析的优势以及存在的问题

(一)甲基化作为检测对象的优势

1．甲基化型既能反映有关基因功能状态及与此相

连的多种疾病相关的丰富信息。叉具有简单的“二元

化”性质，即令甲基化为“0”，非甲基化为“1”，就可以进

行数字化处理，便于开展大规模和自动化监测分析。

2．dna分子十分稳定。有可能将它和dna的snp

分析等置于同一个技术平台。同时它又比rna和蛋白

质更便于保存和运输。并可对已经石蜡、甲醛或乙醇预

· 288 ·

_f 簟

图3 联台甲基化敏豫性限制性内切酶的mbd (compare-ms)示

意围。用甲基化以外的位点的内切酶ia酶)与甲基化敏雅的内切酶(b

酶)联用．则甲基化的dna链不被切开。非甲基化的切开．再行mbd

捕获存在甲基化位点的dna片段。最后行实时pcr扩增并分析。f删

处理的样本进行分析，可以开发历史上储备的病理学资

料。

(二)存在的问题

目前还未找到dna甲基化改变与年龄之间的精

确的量化关系式。虽然人们对个体细胞的衰老及其基

因甲基化水平的改变有了初步的了解．但还在研究探

索二者之问的精确的量化关系。[201对使用dna甲基

化改变来推断个体年龄的大小，仍需要进行大量的研

究和调查。

(三)付诸于实践之前还必须解决的问题

1．确定表观遗传修饰与特定生理指标的相关性：

2证实将这些指标作为鉴别诊断的潜在可能性和

技术可行性：

3．通过一定规模的流行病学调查来验证实验室内

的表观遗传生理及病理发现在人群中的真实性。

五、dna甲基化在法医学中判定个体年龄上的展

望

目前，研究dna甲基化水平改变与个体年龄的

相关性尚处于试验阶段，但已引起许多学者的关注。

人类表观基因组协会(human epigenome con—sortium，

hec)于20__年1o月正式宣布开始投资和实施人类

表观基因组 计划(human epigenome project，hep)。

dna甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的

重要研究内容，hep的最终目标是就要确认这些dna

甲基化位点在人类基因组的分布与频率，以指导和系

统研究dna甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因

印记等发挥的作用。 借助于该计划的实施和分子生

物学技术的发展，在法医实践中可以通过调查各年龄

段人群基因组dna甲基化分布以及相关频率，建立

相关统计学模型，将来有望成为法医个体年龄判定的

一项重要的生物学指标。(感谢西安交通大学医学院第一附

法律与医学杂志20__年第l3卷(第4期)

属医院妇产科、环境与疾病相关教育部重点实验室郑鹏生教授

和顾婷婷同学的支持和帮助。)

参考文献

【1 j 马宏，张宗玉，童坦君．衰老的生物学标志[j】．生理科学进展，20__，

33：65—69

[2】陈朝飞，房静远．衰老的表观遗传修饰研究[j】．上海医学，20__，29

(1)：58～60

【3】dahlc，guldbergp．dnamethylationanalysistechniques[j】．biogerontology，

20__，4(4)：233~250

【4 ] bird a p．cpg—rich islands and the function ofdna methylation[j]．

nature，1986，321：209~231

【5 j depamphilis ml，zorbas h．identifying 5一methyic 08ine and related

modifications in dna genomes[j】．nucleic acids res．1998，26(10)：

2255～2264

[6】 黄庆，郭颖，府伟灵．人类表观基因组计划[jj’生命的化学，20__，24

(2)：101~102

[7】董玉玮，侯进慧，朱必才，等．表观遗传学的相关概念和研究进展叨．

生命的化学，20__，22(1)：1~3

[8】feinberg a p，tycko b．the history of cancer epigeneticⅲ．nat rev

cancer，20__，4(2)：l43-153

[9】李素婷．真核生物dna甲基化状态ⅲ．河北医学，1999，5：85-88

[1o】 陈培利，童坦君，张宗玉．dna甲基化埘基因表达的影响及其在衰

老过程中的表现ⅲ．同外医学分子生物学分册，20__，22：155~168

[il】毛泽斌，张宗 ，童坦军．dna去甲基化对细胞衰老的影响【j1l生物

化学杂志，l997，l3(3)：318 32l

[12】lustig aj，kurtz s，shore d．involvement of the silencer and usa

binding protein rap1 in regulation of telomere length[j】．science，

l 990．250：549~553

[13】kuo k c，mccune r a，gehrke c w，et a1．quantitative reversed—

phase high performanceliquid chromatographic determination of ma—

jor and modified deoxyribonucleosides in dna ⅲ．nucleic acids

res．1980．8：4763~4776

[1 4j 邓大君，邓国仁，吕有勇，等．变性高效液相色谱法检测cpg岛胞

嘧啶甲基化ⅲ．中华医学杂志，20__，81(3)：158~161

[15】朱燕．dna的甲基化的分析与状态检测ⅲ．现代预防医学，20__，

32(9)：1070~1073

[16】herman j g，graft j r，myohanen s，et a1．methylation—specific

pcr：a novel pcr assay for methylation status of cpg islands [j】．

proe natl acad sci usa，1996，93(18)，9821~9826

[1_7】沈佳尧，侯鹏，祭美菊，等．dna甲基化方法研究现状[j】_生命的化

学．20__，23(2)：149~l5l

[1 8】hatada i，hayashizaki y，himtsune s，et a1．a genomic scanning

method for higher organisms using restriction sites∞landmarks [j]．

pmc natl acad sci usa，1991，88：9523—9527

[19】yegnasubramanian s，lin x，haffner m c，et a1．combination of

methylated—-dna precipitation and methylation—-sensitive restriction

enzymes(compare-ms)for the rapid。sensitive and quantitative

deleelion of dna methylation[j】．nucleic acids res，20__，34(3)：

el9

【20】lssa jp．aging，dna methylation and cancer[jl，cri rev oncool hematol，

l999，32：3l一43

(收稿：20__—06—02；修回：20__—09—12)