肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞对扩心病大鼠心肌纤维化和凋亡的影响

【摘要】 目的 通过移植人肝细胞生长因子(hHGF)基因修饰的骨髓间充质干细胞(MSCs)和未经修饰的MSCs来比较二者对扩张型心肌病(DCM)心力衰竭大鼠心功能的影响,并比较它们对心肌纤维化和凋亡的影响。方法 50只12周龄清洁级雄性SD大鼠随机抽取14只作为对照组,其余36只大鼠腹腔注射盐酸阿霉素制作DCM心力衰竭大鼠。存活大鼠(n=24)再随机平分为3组:DCM模型组、MSCs移植组和hHGF基因修饰的MSCs(MSCs-hHGF)移植组。经尾静脉移植干细胞4周后,分别检测左室收缩峰压(LVSP)、左室舒张末期压(LVEDP)、左室内压最大变化速率(±dp/dtmax),然后比较各组心功能改变情况;免疫组化检测心肌hHGF含量;天狼猩红染色评价心肌胶原含量和TUNEL法检测心肌凋亡指数(AI)。结果 与模型组相比,MSCs组和MSCs-hHGF组的左室收缩峰压(LVSP)均升高,左室舒张末期压(LVEDP)均降低,心肌胶原含量均降低,AI均下降;与MSCs组相比,MSCs-hHGF组LVSP升高,LVEDP降低,心肌胶原含量降低,AI无明显差异。MSCs-hHGF组心肌hHGF含量显著高于其他各组,其他组间无差异。结论 MSCs-hHGF组比MSCs组能更加显著地改善DCM心力衰竭大鼠心功能,可能与MSCs-hHGF分泌的hHGF能够进一步抑制心肌纤维化有关;心功能的进一步提高不能归因于hHGF可能存在的抗心肌凋亡效应。

【关键词】

肝细胞生长因子;骨髓间充质干细胞;扩张型心肌病心力衰竭;心肌纤维化;心肌凋亡;移植

Effects of MSCs modified by hepatocyte growth factor on myocardial fibrosis and apoptosis of dilated cardiomyopathy rats

HU Yu，LIN Meipin，XU Chang-shen，et al. First affiliated hospital of hospital of Fujian medical university,Fujian 350005,China

【Abstract】 Objective To compare the effects of transplantation of bone marrow-derived meshenchymal stem cells (MSCs) modified by human hepatocyte growth factor(hHGF) gene (MSCs-hHGF) and MSCs modified by nothing on heart function，myocardial fibrosis and apoptosis of rat model of dilated cardiomyopathy.Methods A total of 50 male SD rats (12-week-old) were included, of which 14 rats were randomly selected and served as control group. A model of dilated cardiomyopathy was induced by intraperitoneal injection of doxorubicin hydrochloride in the remaining rats (n=36). The survivals of rats (n=24) were randomly divided into three groups, the DCM model group, the MSCs transplantation group and the MSCs-hHGF transplantation group.4 weeks after caudal vein stem cells transplantation， left ventricle systolic pressures (LVSP)，left ventricular end-diastolic pressures (LVEDP) and the maximum rate of change of left ventricular pressure，(±dp/dtmax)were evaluated so as to compare heart function among all groups.Immunohistochemical staining was used to examine the expression of hHGF in myocardial tissue. The myocardial collagen content was assessed by Sirius red staining,and myocardial apoptosis index（AI）was detected by TUNEL straining. Results Compared to the DCM model group,LVSP and ±dp/dt max of both MSCs-hHGF group and MSCs group increased obviously，while their LVEDP，myocardial collagen content and AI decreased pared to the MSCs group, LVSP and ±dp/dtmax of the MSCs-hHGF group further increased significantly， while its LVEDP、myocardial collagen content further decreased. However,the myocardial AI is similar between the two groups.The hHGF expression in myocardial tissue of the MSCs-hHGF group was much higher than other groups， there was no statistically significant difference on AI among three other groups. Conclusion The MSCs-hHGF group could further improve heart function of DCM heart failure rats than the MSCs group,which is probably associate with the secreted hHGF from MSCs-hHGF being able to inhibit myocardial fibrosis;the more significantly improved heart function in the MSCs-hHGF group is better than in the MSCs group could not be attributed to the potentially inhibiting myocardial apoptosis effect of hHGF.

【Key words】 Hepatocyte growth factor;Bone marrow-derived meshenchymal stem cells;Heart failure of dilate cardiomyopathy;Myocardial fibrosis;myocardial apoptosis;Transplantation

移植骨髓间充质干细胞(mesencgymalstemcells,MSCs)实验性治疗扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy,DCM)心力衰竭近年来取得了一定的成效,但还不够理想[1]。MSCs是一类可向心肌等多种细胞谱系分化的干细胞[2],它可能通过旁分泌机制或分化为心肌的方式改善心功能[3]。肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)是一种具有较强的抗纤维化和抗凋亡活性的多功能因子[4]。本实验比较移植人肝细胞生长因子(hHGF)基因修饰的MSCs和未经修饰的MSCs二者对DCM心力衰竭大鼠心功能的影响,并对其主要机制作初步探讨。

1 资料与方法

1.1 材料 50只12周龄清洁级雄性SD大鼠约(200±10)g(上海斯莱克实验动物有限公司);携有人肝细胞生长因子的腺病毒(ad-hHGF)(北京军事医学科学院放射研究所),注射用盐酸阿霉素(国药准字H33021980),兔抗hHGF和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体及二氨基联苯胺显色试剂盒皆购自北京中杉金桥生物有限公司。TUNEL凋亡试剂盒(Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和心力衰竭模型的建立 50只12周龄清洁级雄性SD大鼠,随机抽取36只制作心衰大鼠模型,将盐酸阿霉素稀释成5mg/mL,腹腔注射2mg/(kg•次),每周1次,连续6周。另外,14只作为对照组,注射氯化钠溶液。建模期间死亡6只,模型成功大鼠(n=30)与对照组(n=14)分别取6只做模型鉴定。剩余心衰大鼠随机分为3组:模型组(n=8),MSCs组(n=8),MSCs-hHGF组(n=8);此外对照组8只。

1.2.2 MSCs的分离培养和纯化 用DMEM培养液对股骨骨髓腔进行反复冲洗,离心后用淋巴细胞分离液提取MSCs,接种于培养瓶中,约3～4d换液1次。原代培养的细胞生长至铺满瓶壁的2/3以上时,即可传代。重复消化传代,本研究以第3代MSCs作为移植治疗细胞。

1.2.3 重组腺病毒Ad-hHGF的扩增和Ad-hHGF体外感染MSCs,待293细胞于培养瓶中生长到90%汇合状态时,感染强度MOI按10个空斑形成单位/细胞的量加入病毒,36~48h后,细胞出现完全的致细胞病变效应(CPE)时,将293细胞于-80℃和37℃间反复冻融3次,离心后收集病毒上清保存于-80℃。将MSCs(约1×106个)37℃培养24h,吸出原培养液,分别加入不同MOI的Ad-GFP,MOI分别为25、50、100、200pfu/细胞,以DMEM作为对照,每瓶加3ml培养液,每24h换一次培养液,当细胞达到80%~90%融合后,用0.125%的胰蛋白酶消化,以DMEM培养基终止反应。

1.2.4 细胞移植 造模成功后,通过尾静脉移植MSCs,MSCs组移植MSCs100μL(约3×106)个/只,MSCs-hHGF组移植MSCs-hHGF100μL(约3×106个),模型组和对照组各注射等量DMEM培养基。

1.2.5 大鼠心功能的评价 移植后4周,经右颈总动脉插入硅胶管,另一端连接压力换能器,接于生理多导记录仪。分别记录左室收缩峰压(LVSP)、左室舒张末期压(LVEDP)、左室内压最大变化速率(±dp/dtmax)。

1.2.6 免疫组织化学分析检测hHGF 严格按照生产商提供的说明书步骤进行二步法操作,其中兔单克隆hHGF抗体用PBS溶液150倍稀释。

1.2.7 天狼星红染色心肌胶原纤维 石蜡切片常规脱腊至水,入0.1%苦味酸天狼星红染液中染色2h,冲洗封片。

1.2.8 TUNEL法即脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测心肌细胞凋亡 严格按照Roche公司相关说明书进行操作。

1.2.9 统计方法 计量资料用均值±标准差(mean±SD)表示,SPSS13.0统计软件处理数据,多个样本的均数比较采用单因素方差分析,两组间比较采用LSD-t检验。P

2 结果

2.1 移植后大鼠心功能的比较

2.2 天狼星红染色结果 图1中红色为胶原纤维。心肌胶原容积分数(CVF)分析:与模型组相比,MSCs-hHGF组和MSCs组CVF皆显著降低(P

图1

心肌胶原天狼猩红染色结果(n=8,×100)

2.3 心肌中hHGF的免疫组化 图2中金黄色为hHGF在心肌中的表达,MSCs-hHGF组hHGF含量明显高于其他各组(P0.05)。各组吸光度值(OD)如下:对照组OD=175,DCM模型组OD=162;MSCs组OD=183;MSCs-hHGF组OD=4254。

2.4 心肌细胞凋亡(TUNEL法)结果 图3中蓝色为正常心肌胞核,黄色为DAB染色的凋亡胞核。同模型组相比,MSCs-hHGF组和MSCs组心肌AI明显减小(P

图2

心肌hHGF的表达(n=8,×100)

图3

心肌TUNEL法凋亡结果

3 讨论

将MSCs直接注射到DCM心力衰竭大鼠的心肌内,发现可以提高心功能[1],但是类似此种MSCs移植治疗效果仍然有限[5]。HGF是间质细胞产生的一种多功能因子[4]。研究发现HGF具有抑制DCM心肌组织纤维化和抗心肌凋亡的能力[6]。腺病毒为载体介导hHGF修饰MSCs,对MSCs的增殖和分化没有影响,但可明显促进MSCs的迁移和归巢[7]。移植hHGF基因修饰的MSCs,通过局部高表达hHGF,改善心肌微环境,可进一步提高心功能。

腹腔注射阿霉素建立大鼠DCM心力衰竭模型成功率高稳定性好,本实验大鼠收缩功能(LVSP和+dp/dtmax上升)和舒张功能(LVEDP和-dp/dtmax下降)均明显提高,表明模型建立成功。移植4周后,MSCs-hHGF组心功能较MSCs组改善更为显著,而MSCs-hHGF组心肌中hHGF含量明显高于其他组,可推测MSCs分泌hHGF可对提高心功能起到重要的介导作用。

心肌纤维化DCM发展到心力衰竭阶段的一个重要原因,同模型组心肌胶原含量相比,MSCs-hHGF组比MSCs组进一步减少,除了说明仅MSCs本身就有抑制DCM心肌纤维化的作用外之外[1],还可推测hHGF是MSCs-hHGF组心功能获得进一步提高关键因子。但是HGF究竟是通过什么机制抑制纤维化目前尚不清楚。Nakamura认为与HGF激活基质金属蛋白酶系统(MMPs)有关[8],MMPs是胶原代谢的关键酶,其中的胶原酶(如MMP-1)主要水解I、Ⅱ、Ⅲ型胶原,而I型和Ⅲ型胶原占心脏胶原总量的90%,故其影响作用甚大。转化生长因子β(TGF-β)是具有促进胶原蛋白和纤黏蛋白沉积的细胞因子,HGF还可能通过降低TGF-β抑制心肌纤维化[9]。

心肌过度凋亡是DCM走向心力衰竭的一个重要病理原因。HGF可抑制DCM的心肌细胞过度凋亡[4],不过本实验并没有观察到预期中MSCs-hHGF组的凋亡率小于MSCs组,说明hHGF并没有发挥明显的抗凋亡效应。可能一方面因为MSCs本身就有抗心肌凋亡作用而hHGF只是一个短期的分泌,不能对心肌凋亡产生明显影响,另一方面TUNEL法这种检测手段灵敏度高易产生假阳性。还有本实验样本量较小,当然也不能完全排除hHGF对DCM的心肌凋亡原本影响就很小等原因。从本实验分析,减少心肌凋亡主要归功于MSCs的旁分泌功能或心肌样变。MSCs分泌的干细胞生长因子、血管内皮生长因子等均被认为有一定的抗凋亡作用[3]。若分化为心肌细胞也可降低凋亡率,但心肌凋亡的影响因素比较复杂,有待进一步的研究。

治疗DCM心力衰竭大鼠,MSCs-hHGF组比MSCs组能更加显著地改善心功能,可能与MSCs-hHGF分泌的hHGF能够进一步抑制心肌纤维化有关;而分泌的hHGF并未表现出显著的抗心肌凋亡效应,故心功能的进一步改善不能归因于hHGF可能存在的抗心肌凋亡效应。究其具体机制目前还不清楚,细胞联合基因治疗DCM心力衰竭尚处于起步探索阶段,还有许多问题有待进一步探索。

参 考 文 献

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［3］ Tang Y L，Zhao Q，Qin XY，et al.Paracrine Action Enhances the Efects of Autologous Mesenchymal Stem Cel1 Transplantation on Vascular Regeneration in Rat Model of Myocardial Infarction.Ann Thorac Surg，2005，80：229-237.

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［7］ 刘红军，吴祖泽，王立生，等.肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响.中国试验血液学杂志，2005，13（6）：1044-1048.

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