吸烟者树突状细胞的功能状态研究分析

【摘要】 目的 研究吸烟者树突状细胞(DC)的功能。方法 分离吸烟者和非吸烟者外周血单个核细胞(PBMC)，在含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素4(IL-4)的培养条件下制备DC。流式细胞仪检测DC表面CD86的表达；混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC对T淋巴细胞的刺激能力；酶群免疫吸附法(ELISA)测定MLR上清液中细胞因子水平。结果 与非吸烟者比较，吸烟者DC表面CD86的表达明显增高，对T淋巴细胞的刺激能力增强；致炎细胞因子(IL-1β)分泌增多，抑炎因子(IL-10)分泌减少。结论 吸烟者DC明显激活，可能是吸烟致动脉粥样硬化的机制之一。

【关键词】 吸烟；树突状细胞；细胞因子；动脉粥样硬化

【Abstract】 Objective To investigate the function of dendritic cells (DCs) in smoking person.Methods DCs were derived from human periphery blood monocyte cells (PBMCs) upon culture with interleukin-4 (IL-4) and granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) from smoking person.The surface co-stimulatory factor CD86 (7-2) of DCs were assessed by flow cytometry.Immunostimulatory capacity was measured by mixed lymphocyte reaction (MLR). ELISA was used to analyze the level of cytokines (IL-1β，IL-10).Results Much more CD86 was expressed on DCs from smoking person.The stimulating capacity of DCs in MLR was higher，and the T lymphocytes in MLR produced higher levels of pro-inflammation cytokines and lower levels of restrin-inflammation cytokines，compared with normal group.Conclusion DCs of smoking person are activated，which may play an important role in the progress of atherosclerosis (AS).

近年发现免疫炎性反应在促进动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发病中起重要作用［1］。研究发现体内功能最强的专职性抗原提呈细胞树突状细胞(dendritic cell，DC)在AS斑块中聚集增多，提示其所介导免疫炎性反应参与了AS的发生和发展［2］。吸烟是心脑血管疾病的重要危险因素之一［3］，有观察表明吸烟可激活体内的炎性反应［4］，但吸烟是否影响DC功能从而促进AS的发生与发展，目前尚少有报道。本文通过观察吸烟者DC的功能状态，进一步阐明吸烟致AS的可能机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取吸烟和非吸烟者各30例，两组年龄、性别等无明显差异。所有对象均排除急慢性炎性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤，未用激素及免疫抑制剂。

1.2 材料 RPMI1640(L-glutamine)培养基、胎牛

血清(FCS)购自Gibco公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司；四唑盐(MTT)、二甲亚砜(DSMO)购自广州威佳公司；重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素-4(rhIL-4)购自英国Peprotech公司；PE标记的鼠抗人CD86(B7-2)单抗购自Biolegend公司；白细胞介素-1β(IL-1β)、白介素-10(IL-10)ELISA试剂盒购自美晶公司。

1.3 方法

1.3.1 DC制备 抽取受试者外周血20ml，淋巴细胞分离液中离心(2000r/min，20min)，收集单个核细胞(PBMC)，PBS冲洗2次，RPMI 1640冲洗1次，用完全RPMI 1640(含10%FCS)在6孔培养板中培养2h(37℃，5%CO2)，去掉非贴壁细胞。贴壁细胞用完全RPMI 1640(含10%FCS、rhGM-CSF 100ng/ml、rhIL-4 500u/ml)培养液，置37℃、5%CO2温箱中培养7天，隔天半量换液1次。收集培养第7天的悬浮细胞即DC进行实验。

1.3.2 DC形态 于培养第1、3、5、7天在倒置显微镜下观察DC形态。

1.3.3 流式细胞学分析 收集DC细胞，用PE标记的CD86(B7-2)单抗标记细胞，用流式细胞仪(FACS，美国Becton Dickinson)检测。

1.3.4 混合淋巴细胞反应(MLR) 反应中淋巴细胞来自其他健康供血员的PBMC，经T细胞尼龙毛柱分离后，得到纯的T淋巴细胞。浓度为2×105/ml的T淋细胞与浓度为2×104/ml的DC各100μl在96孔平底培养板中37℃、5%CO2条件下混合培养，第4天吸取上清液-20℃保存待测细胞因子，沉淀细胞加MTT液(25μl/孔)，继续培养4h后每孔加DMSO 100μl，波长570nm处测A值。

1.3.5 细胞因子测定 酶联免疫吸附法(ELISA法)分别检测保存的混合淋巴细胞反应上清液IL-1β和IL-10浓度，操作严格按试剂盒说明进行。

1.4 统计学方法 应用SPSS 10.0软件系统分析，所有资料采用均数±标准差(x±s)表示，组间差异用t检验(Independent-Samples T test)。P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 DC形态学特点 光学显微镜下可见细胞表面伸出树突样结构，长短不一，呈簇状生长，为典型的DC细胞。吸烟者和非吸烟者DC在形态上无差别。

2.2 吸烟者DC的功能 吸烟者DC表面CD86表达明显高于非吸烟者(P＜0.001)，吸烟者DC刺激T淋巴细胞增殖能力显著高于对照组(P＜0.001)。如表1所示。 表1 吸烟者DC功能 (x±s)

注：与非吸烟组比较，*P＜0.001

2.3 细胞因子测定 吸烟者MLR上清液中促炎细胞因子IL-1β显著高于对照组，而抑炎细胞因子IL-10低于对照组，如表2所示。

表2 MLR上清液中细胞因子浓度 (ng/ml，x±s)

注：与非吸烟组比较，*P＜0.001

3 讨论 近年研究证明，动脉粥样硬化(AS)为一炎性疾病［1］，在AS斑块中有大量免疫炎性细胞如T淋巴细胞、巨噬细胞等［5］。DC是体内效应最强的专职性抗原呈递细胞，其激活T淋巴细胞的能力是巨噬细胞或B细胞的100～1000倍，T淋巴细胞必须与之接触才能被激活［6］。Bobryshev等［7］发现AS斑块中DC亦聚集增多，认为DC介导的免疫炎性反应可能参与了AS的发病。吸烟是心血管事件的危险因素［3］，烟雾的重要成分尼古丁可通过损伤血管内皮、干扰脂代谢、激活凝血系统等参与AS的发生和发展过程［8］。有观察表明吸烟与系统中的炎性标志物相关［4］，Aricher等［9］报道尼古丁在体外具有强烈的激活DC的作用，提示吸烟可能影响机体免疫炎性反应。本文研究结果表明，吸烟者DC处于激活状态，表现为表面共刺激因子CD86表达明显升高，对T淋巴细胞的促增殖作用加强，T淋巴细胞分泌促炎因子增多，而抑炎因子分泌减少。由于DC的激活，其所介导的免疫炎性反应受到增强，加重了对血管壁的损伤，AS斑块的不稳定性增加，从而导致了AS的发生与发展。因此，可以认为吸烟对DC的激活作用是其导致AS的机制之一。

【参考文献】

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7 Bobryshev YV，Lord RS.Structural heterogeneity and contacting interactions of vascular dendritic cells in early atherosclerotic lesions of the human arota. J Submicrosc Cytol Pathol，1996，28:49-60.

8 Metz L，Waters DD.Implications of cigarette smoking for the management of patients with acute coronary syndrome.Prog Cardiovasc Dis，2003，46:1-9.

9 Aricher A，Heeschen C，Mohaupt M，et al.Nicotine strongly activates dendritic cell mediated adaptive immunity:potential role for progression of atherosclerotic lesion.Circulation，2003，107:604-611.