近红外光谱用于大孔树脂纯化栀子提取物放大过程的监测研究

[摘要]采用小试近红外（NIR）分析模型监测大孔树脂纯化栀子提取物的放大过程。首先，收集小试纯化过程中的乙醇洗脱液，采集其近红外光谱，采用HPLC测定栀子苷含量，并采用偏最小二乘法（PLS）建立NIR光谱预测栀子苷含量的定量模型。然后，用该模型对中试过程醇洗脱液中栀子苷浓度的变化进行监测。结果表明，小试NIR模型对中试过程中栀子苷浓度的预测效果良好，然而随着实验批次的进行，模型的预测性能有所下降，因此用模型更新的方法对该模型进行维护。经过2次更新后，模型可以对中试过程中栀子苷的浓度进行准确预测。通过模型更新将小试规模建立的NIR定量模型应用于不同规模的大孔树脂纯化过程，可提高小试过程数据的利用效率，并且节省中试过程重新建立模型的成本。

[关键词]模型转移；大孔树脂；近红外光谱法；栀子苷；偏最小二乘法

[Abstract]To establish a fast detection method during the purifying process of the extracts from Grardeniae using macroporous resin based on near infrared spectroscopy. First， the ethanol eluent was collected from the purification process of small size sample； and near infrared （NIR） spectrum was collected. Then the content of the geniposide was determined by HPLC method， and partial least squares （PLS） method was used to establish the quantitative model to predict the content of geniposide by NIR spectrum. This model was used to supervise the changes of geniposide concentrations in ethanol eluent during medium scale process. Experimental results showed that the NIR small scale model can accurately predict the concentrations of geniposide in the production process of medium scale. However， with the proceeding of batch processes， the prediction performance of the model was decreased， so model updating method was employed to maintain the model. After twice updates， the NIR quantitative model can accurately predict the concentrations of the geniposide during medium scale process. Therefore， through model updates， the established NIR quantitative model can be applied in different scales of macroporous resin purification processes， to improve the data utilization efficiency of small scale process and save the cost of rebuilding the quantitative model of medium scale.

[Key words]model transfer； macroporous resin； near infrared spectroscopy； geniposide； partial least squares

doi：10.4268/cjcmm20160310

中药栀子常用于临床消炎、利尿、利胆和止血等[1]。栀子苷是栀子药材中最主要的环烯醚萜类成分，具有多种药理作用[2-4]。目前，硅胶柱色谱法、双水相萃取法、高速逆流色谱法和大孔吸附树脂法均有用于分离纯化栀子苷的报道[5-8]。其中，大孔吸附树脂法以其成本低、选择性好、吸附容量大、再生处理方便等优势，更适于栀子提取物的大规模纯化[9]。

大孔树脂纯化工艺放大是制药工艺开发的难点之一，将小试生产过程稳定地在中试过程中重现是工艺放大成功的关键。在工艺放大研究初期，通常需要采用简单有效的方法对大规模生产过程进行监控，以判断小试工艺是否能在中试过程取得相同的结果，并减少大规模生产时的物料损失。近红外（near infrared，NIR）光谱技术具有快速无损、准确高效以及不消耗化学试剂等优点。近年来在大孔吸附树脂纯化过程监测中的应用逐渐增多等[10-12]。近红外光谱定量分析技术可实时反映过程中有效成分或指标性成分含量的变化。定量分析需建立定量校正模型，建模过程费时费力，且模型的维护成本较高。目前已有学者对近红外定量模型转移进行研究，研究主要集中在不同仪器之间定量模型的转移[13-15]。

本文以大孔吸附树脂纯化栀子提取物的乙醇洗脱过程为研究对象，采用近红外光谱技术对醇洗脱过程进行监测。用小试纯化过程中所采集样本建立栀子苷近红外定量分析模型，并探索将小试规模下建立的近红外定量分析模型应用于中试纯化过程，预测中试规模洗脱过程中栀子苷含量的动态变化，并且使用中试过程中的样品对该模型进行更新，提高模型的预测性能。

1材料

Antaris Nicolet FT-NIR近红外光谱仪（美国Thermo公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent科技有限公司）；Sartorius BS210S天平（德国Sartorius公司）；BT100-1L型蠕动泵（保定兰格恒流泵有限公司）；PALL色谱柱（美国PALL公司）；色谱柱（上海锦华色谱设备厂）；超声清洗器（KQ-500B型）。

自制栀子提取物；非极性大孔吸附树脂（天津南开大学化工厂）；栀子苷对照品（批号24512-63-8，成都普菲尔德生物技术有限公司）；乙腈（色谱纯，美国Thermo公司）；其他试剂均为分析纯。

2方法

2.1树脂预处理先将大孔树脂于95%乙醇中浸泡12 h，用去离子水洗净残留在树脂中的乙醇，再用2倍树脂床体积1 mol・mL-1的盐酸冲洗，用去离子水冲去残留在树脂内的盐酸，再用2 g・mL-1的氢氧化钠溶液2倍树脂床体积冲洗，最后将树脂洗至中性，备用。

2.2纯化过程栀子提取物的大孔树脂纯化过程分别在2种不同规格的色谱柱上实现。2种色谱柱的规格分别为（1.5 cm×25 cm）和（3.5 cm×60 cm）。小色谱柱的柱体积为15 mL（称为小试过程），大色谱柱的柱体积为190.5 mL（称为中试过程），纯化规模放大12.7倍。

小试纯化过程： 将2 g栀子提取物粉末溶于10 mL去离子水中，制成0.2 g・mL-1的溶液，然后将该溶液以0.3 mL・min-1流速加入到色谱柱中，再用5倍树脂床体积的去离子水以2.5 mL・min-1流速洗去杂质，最后用8倍树脂床体积的50%乙醇以1.2 mL・min-1的流速洗脱栀子苷。整个洗脱过程中，取样间隔为：2 min（0～20 min），2.5 min（21～70 min），2 min（71～90 min），2.5 min（91～100 min）。小试过程进行4次实验，用于建立初始校正模型。为扩大初始模型所包含的信息，批次2，3的醇洗脱过程中的乙醇浓度分别调整为48%，52%。

中试纯化过程： 将25 g提取物粉末溶于125 mL去离子水中，制成0.2 g・mL-1的溶液，将该溶液以0.73 mL・min-1流速加入到色谱柱中，再用5倍树脂床体积的去离子水以10.75 mL・min-1流速洗去杂质，最后用8倍树脂床体积的50%乙醇以5.2 mL・min-1洗脱栀子苷。第1批实验中，取样间隔为： 4 min（1～40 min），5 min（41～140 min），6 min（141～200 min），20 min（201～290 min）。第2，3批实验中，取样间隔调整为： 4 min（1～40 min），5 min（41～210 min）。中试过程进行3次实验，用于NIR监控模型转移的研究。

2.3近红外测定采用透射模式采集近红外光谱，光程为8 mm，分辨率为4 cm-1，扫描范围10 000～4 000 cm-1，扫描次数次32，增益为2。为减少测量误差，每个样品平行集3次光谱，以3次光谱的平均值作为最终光谱。

2.4液相测定精密量取测定近红外后的样品溶液适量，以50%甲醇适当稀释，并过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液进行HPLC分析。色谱柱为Phenomenex C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱，梯度程序：5% A（0～15 min），15%～45% A（16～30 min），45% A（31～35 min）。检测波长238 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL，流速1.0 mL・min-1。

2.5模型建立与评价采用SIMCA P+11.5（Umetrics，瑞典）软件进行光谱预处理，其他算法在Matlab 7.0（MathWorks，美国）平台上实现。采用Kennard-Stone（K-S）算法，按照校正集和验证集3∶1划分样本集建立定量校正模型。PLS模型的性能由相关系数（r），校正均方根误差（the root mean squared error of calibration，RMSEC），交叉验证均方根误差（the root mean squared error of cross validation，RMSECV），预测均方根误差（the root mean squared error of prediction，RMSEP）和性能偏差比（ratio of performance to deviation，RPD）进行评价。

3结果和讨论

3.1栀子苷的HPLC测定精密称取栀子苷对照品10.54 mg，制成质量浓度为63.24 mg・L-1的对照品储备液。按上述色谱条件分别进样1，2，4，6，8，10，12 μL，记录栀子苷的峰面积。以栀子苷含量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程y=13.18x+16.87（r=0.999 9，n=7）。结果显示，栀子苷在12.65～88.54 mg・L-1校正关系良好。HPLC图见图1。

3.2小试校正模型建立和验证NIR光谱中一般含有一些较弱、非专属性的吸收波段，其中一些波段可能含有无意义或不相关的信息（比如噪音或背景），这些信息可能会导致模型的性能降低[16-17]。因此，有必要对NIR光谱进行预处理和波段筛选。本文采用7种不同的方法对NIR光谱进行预处理，分别为SG平滑（savitzky-golay smoothing）、一阶导数（first order derivatives）、二阶导数（second order derivatives）、小波去噪（wavelet denoise spectral，WDS）、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、标准正则变换（standard normal variate transformation，SNV）和基线校正（baseline）。采用原始光谱和预处理后的光谱分别建立PLS模型，以RMSEV，RMSECV，RMSEP，RPD为指标，其中RMSEC，RMSECV，RMSEP越小越好，而RPD越大越好。各模型的参数见表1。可以看出，SG平滑为最优的预处理方法，其RMSEV，RMSECV，RMSEP，RPD分别为1.338 g・L-1，1.662 g・L-1，1.791 g・L-1，1.80。

然而，该模型的性能并不能满足应用要求，因此采用间隔偏最小二乘法（interval PLS，iPLS）法对SG平滑后的光谱进行波段筛选。最终选定5 805～6 102 cm-1为最佳波段，见图2。模型校正见图3（A），当潜变量因子为10时，模型的RMSEC，RMSECV，RMSEP和Cummulative PRESS（累积预测误差平方和）趋于平缓且数值均较小，可以满足模型的应用要求。以该模型预测小试第4次实验的醇洗脱过程，其模型的rcal，RMSEC，RMSECV，rval，RMSEP，RPD分别为0.988 9，0.478 g・L-1，0.584 g・L-1，0.993 2，0.408 g・L-1，7.92。图3显示校正集和验证集中的NIR预测值和HPLC测定值相关关系良好，且预测集样本（红色实心圆点）基本上落在校正集（黑色空心圆点）内。

3.3小试NIR模型在中试过程中的应用和更新在上样原料和载体树脂等条件不发生改变的情况下，使用小试NIR定量模型对中试过程进行分析。本文对小试过程和中试过程中样品的近红外光谱进行PCA分析，判断2个纯化规模的光谱在主成分空间中的分布是否存在差异，见图4。可以看出，中试过程的样品（红色、蓝色和绿色空心圆点）基本分布在小试模型（黑色实心圆点）的校正集范围之内。因此，可以利用小试过程的监控模型对中试过程进行预测。

采用小试过程建立的NIR模型对中试过程洗脱阶段进行预测。3批中试数据的预测结果见表2，图5。从表2可以看出，该模型对中试过程进行预测时，其rval和RPD呈下降趋势，而偏差和RMSEP呈上升趋势。从图5中可以看出，在3批中试数据中，近红外的预测值在高浓度点高于液相值，而在第2，3批数据的低浓度点近红外的预测值呈现出一定的波动。因此，对小试过程和中试过程的液相数据进行比较，见图6。从图6（A）中可以发现，在第20个取样点以前，中试过程的栀子苷浓度高于小试过程，说明小试过程模型校正集未包含中试过程中高浓度的点，导致对高浓度点的预测性能较差。第20个取样点以后，2规模实验中各取样点的栀子苷浓度虽然基本重合在一起，但是中试第1批与第2，3批的光谱存在明显差异，见图4，说明中试实验过程中光谱存在一定变异，因而导致其对中试第2，3批实验中低浓度点的预测出现一定的波动。同时从图6可以看出，中试过程和小试过程的洗脱行为基本一致，表明中试和小试过程的洗脱过程无明显差异。

采用小试NIR模型对中试过程进行预测的过程中，随着批次的进行，其预测性能呈下降趋势。因此，运用中试过程的数据对小试模型进行更新，提高其对中试过程的预测性能。本文采用K-S算法从中试规模中的1，2批样本中分别选出15个样品，依次加入到小试模型的校正集中，并重新建立PLS校正模型。2次更新后的模型对第3批中试数据进行预测，见表3。经过2次更新后，模型的预测性能显著提高，其RMSEP，RPD分别为0.944 g・L-1，4.14。2次模型更新后对第3批实验的预测结果见图7，更新后的模型预测更加接近液相测量的浓度值。结果表明，更新后的模型可以对第3批实验过程中栀子苷的浓度变化进行更加准确地预测。

4结论

本文将NIR分析技术用于大孔吸附树脂纯化过程的醇洗脱过程监测。以大孔吸附树脂纯化栀子提取物的过程为研究对象，采用小试过程的NIR光谱定量分析模型对中试过程中3个批次实验的醇洗脱过程进行快速分析，并且采用中试过程的样本数据对小试模型进行更新。结果表明，小试过程所建立的模型可以直接对中试过程进行预测。利用中试样本数据对小试模型进行更新后，可以提高小试过程模型对中试过程的预测性能。该方法可以有效的监控大孔树脂纯化工艺放大过程中洗脱行为的变化，为工艺放大的顺利进行提供依据，节省中试过程重新建立定量模型的成本，减少放大过程中的物料损失、人力浪费等。

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