TGF-β1对UVA照射人皮肤成纤维细胞MMP-1和MMP-3 mRNA表达的影响

[摘要]目的:研究转化生长因子- β1(tansforming gowth fctor-beta 1,TGF-β1)对长波紫外线(ultraviolet A,UVA)照射人皮肤成纤维细胞基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)和基质金属蛋白酶-3(matrix metalloprotein ase-3,MMP-3)mRNA表达的影响,探讨TGF-β1对皮肤成纤维细胞的光保护机制。方法:通过体外培养人皮肤成纤维细胞,加入不同浓度TGF-β1(0.1、1、10ng/ml)预处理细胞后UVA15J/cm2照射诱导细胞光老化,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测成纤维细胞增殖活性,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定 MMP-1、MMP-3mRNA表达。 结果:UVA15J/cm2照射前给予不同剂量TGF-β1预处理,随TGF-β1剂量增加成纤维细胞增殖活性明显提高,MMP-1、MMP-3mRNA表达随着TGF-β1剂量增加而降低。结论:TGF-β1可提高UVA照射体外培养成纤维细胞增殖活性,减少UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞MMP-1、MMP-3 mRNA表达,减少其对胶原的降解,对UVA照射皮肤成纤维细胞起保护作用。

[关键词]TGF-β1;UVA;皮肤成纤维细胞;MMP-1;MMP-3

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)01-0053-03

Effects of TGF-β1 on the expression of MMP-1 and MMP-3 mRNA in skin fibroblasts induced by UVA in vitro

HE Yong-jing,LIU Yin,WANG Ji-hua,ZHAO Ya-nan,YANG Yun,LI Ying

(Department of Plastic Surgery,the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming 650101,Yunnan,China)

Abstract:ObjectiveTo invesitgate the expression of matrix metalloproteinase-1 and matrix metalloproteinase-3 of skin fibroblasts induced by UVA radiation treated with various doses of TGF-β1, and investigate its photoaging protect mechanism in vitro.Methods The skin fibroblasts were cultured and irradiated with different doses of UVA. MTT assay was performed to analyze cell proliferation activity,and mRNA expression levels of MMP-1 and MMP-3 were detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). Results The cell proliferation activity decreased with the UVA irradiation, but it increased when ading different doses of TGF-β1.The mRNA expression of MMP-1 and MMP-3 decrease with TGF-β1 increased,and it decreased in a dose-dependent manner. Conclusions TGF-β1 treatmented before UVA irradiation could improve skin fibroblasts proliferation activity in vitro. It is in a dose-dependent manner to decrease the mRNA expression of MMP-1,MMP-3 on UVA irradiated fibroblasts. Which help protect skin fibroblasts from irradiation.

Key words: tansforming gowth factor-beta 1; ultraviolet A; skin fibroblast; MMP-1;MMP-3

皮肤反复暴露于紫外线中导致成纤维细胞胶原合成减少和真皮胶原基质降解,出现皮肤松弛,粗糙,色素沉积、弹性下降,皱纹增多的光老化外观[1]。人体皮肤接受的日光紫外线照射尤其是UVA,能穿透表皮到达真皮,主要造成皮肤内真皮的主体细胞成纤维细胞的损伤。紫外线照射后诱导人皮肤成纤维细胞产生基质金属蛋白酶(MMP)增多,MMP降解胶原和细胞外基质蛋白,在皮肤光老化中起着重要作用[2]。TGF-β1是许多细胞外基质合成的重要调节因子,已经证明TGF-β1能调节基质金属蛋白酶(MMP)包括MMP-1、 MMP-2、MMP-3和MMP-13的表达[3]。体外实验研究发现,用紫外线照射培养的成纤维细胞可导致MMP-1、MMP-3的mRNA高表达,细胞外基质的降解主要与金属基质蛋白酶MMP-1、MMP-3有密切关系[4]。TGF-β1能抑制UVA 照射人皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成和mRNA表达,对UVA照射的成纤维细胞起保护作用[5]。因此,与衰老相关的TGF-β1信号传导途径在减少胶原合成和增加MMP表达方面可能起作用。本实验选用一种生物因子TGF-β1,从分子水平探讨TGF-β1在体外对防治UVA引起的光老化研究的可行性,进一步了解其对UVA照射成纤维细胞MMP-1、MMP-3mRNA表达的影响。

1材料和方法

1.1 主要仪器:UVA 光源(北京光学仪器厂),紫外线辐照计(北京师范大学), PCR仪( Perkin Elmer公司,美国),紫外分光光度计 U-niversal Hood Ⅱ型紫外凝胶成像系统(Bio-Rad公司,意大利) 。

1.2 主要试剂:DMEM、小牛血清、青霉素、链霉素、胰酶、 MTT、Trizol试剂(MRC,美国)、AMV-逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶( Promega,美国)、及内参照β-acting引物、MMP-1、MMP-3引物。

1.3 皮肤成纤维细胞原代培养及传代:取健康青少年男子环切术后的包皮,利用组织块培养法,将皮肤组织放入无菌烧杯中,用含有青霉素,链霉素各100U/ml的PBS反复冲洗,直至液体为无色透明。将皮肤组织放入无菌培养皿中,用眼科剪将皮下组织剪去,剪碎皮肤为近似糊状。将剪碎的组织分成小块贴于25cm2 培养瓶瓶底,组织块之间间隔0.5cm,将瓶底翻转后加入含20%小牛血清的DMEM 9ml后放入细胞培养箱培养4h后翻转使培养液浸没组织块,培养4天后隔日换液,2周后成纤维细胞爬出,待融合80%后常规消化传代,取第5代对数增殖期细胞作为实验用细胞。

1.4 实验细胞分组和不同浓度TGF-β1干预细胞后UVA照射体外培养的成纤维细胞:将细胞以每孔1×105/ml浓度接种在6 孔板上,细胞分为5组,即正常对照组(UVA 0 J/cm2 +TGF-β1 0ng/ml)、UVA单纯照射组(UVA15J/cm2 +TGF-β1 0ng/ml)、小剂量组(UVA 15J/ cm2+TGF-β1 0.1 ng/ml)、中剂量组(UVA 15J/cm2 +TGF-β1 1.0ng/ml)、大剂量组(UVA15 J/cm2 +TGF-β1 10.0 ng/ml)。于小剂量、中剂量和大剂量组细胞中分别加入含TGF-β1 0.1 ng/ml、TGF-β1 1.0 ng/ml 和TGF-β1 10.0 ng/ml的PBS 3ml在细胞培养箱内预处理2h,PBS漂洗两次后各孔加PBS 3ml,用UVA紫外灯照射含UVA单纯照射组在内的四个实验组细胞后置换含10%小牛血清的DMEM置入培养箱中继续培养,24h后收样,吸取培养液后加入PBS洗涤三遍,细胞待检测。

1.5 MTT法检测TGF-β1干预后成纤维细胞增殖活性:用含10%小牛血清的培养液配成单个细胞悬液,以每孔1×105个细胞接种到96孔板,每孔体积200μl.培养1天后,每孔加5mg/ml MTT溶液20μl.继续孵育4h,终止培养,吸弃孔内培养上清液,每孔加150μl DMSO,振荡10min,使结晶物充分融解,选择492nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果。

1.6 半定量RT-PCR检测TGF-β1对UVA照射体外培养成纤维细胞MMP-1、MMP-3 mRNA表达水平的影响:RNA提取,半定量RT-PCR分析:用磷酸缓冲液(PBS) 洗三次,使用Trizol 提取RNA。首先进行反转录反应:取10μg RNA 加入到20μl 反转录反应混合液中,经94℃30 min ,99℃5 min 和5℃5 min 处理。在含有反转录产物的PCR 反应液中, 分别加入MMP-1、MMP-3引物。

MMP-1引物(284bp):

上游引物 5′-GAT GGA TCC CAA GCC ATA TAT GGA CGT TCC-3

下游引物 5′-TTG GAA TTC CGG ACT TCA TCT CTG TC GG -3′MMP-3引物(434bp):

上游引物5′-TAT GGA TCC CCC CCT GAC TCC CCT GAG-3′下游引物 5′-ATG GAA TTC AGG TTC AAG CTT CCT GAG G -3′β-acting做内参照引物(510bp):

上游引物 5′-GCA CTC TTC CAG CCT TTC CTG-3′

下游引物 5′-GGA GTA CTT GCG CTC AGG AGG AGC-3′

PCR 反应体积为25 μl。

扩增条件:预变性94℃ 6 min,接着94℃ 50 s, 55℃ 50 s, 72℃ 1.5 min,30个循环后72℃ 7 min延伸。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳,紫外凝胶成像系统扫描成像扩增产物。

1.8统计学处理:数据以(x±s)表示,用SPSS 13.0统计学软件对组间数据行单因素方差分析, P

2结果

2.1TGF-β1对成纤维细胞增殖活性的影响:选择UVA 15 J/ cm2照射前给予不同剂量TGF-β1预处理,结果显示:正常对照组成纤维细胞OD值明显高于UVA 照射组,有显著性差异(P

align="">

2.2 TGF-β1对MMP-1、 MMP-3mRNA表达的影响:从吸光度值和PCR产物电泳及条带密度扫描显示:正常对照组与UVA照射组比较,有显著性差异(P

3讨论

紫外线照射是导致皮肤日光老化及皮肤癌的重要因素,成纤维细胞是真皮中最主要的细胞成分,紫外线照射会导致该细胞的过早衰老,胶原合成能力下降,MMPs表达增加,细胞外基质(ECM)降解是皮肤光老化的重要因素。长波紫外线穿透能力强,50%的UVA穿透表皮达到真皮层,作用于成纤维细胞。对培养状态下的皮肤细胞(成纤维细胞和角质形成细胞)来说,实验剂量的UV照射均应称之为超生理剂量的UV照射[6]。

转化生长因子(TGF-β)是一大类多功能的细胞生长增殖调节蛋白,由Delarco等于1978年首次发现。TGF-β家族中TGF-β1在体细胞系中所占比例最高(>90%),活性最强,作用范围也十分广泛,它是一种多功能细胞因子,调节细胞的增殖和分化,组织重塑和修复[7]。TGF-β1还是一种潜在的表皮生长抑制剂,对维持组织内环境的稳定起重要作用。然而,对真皮是正向生长因子,能诱导细胞外基质(ECM)的合成[8]。Gambichler对暴露于UVA 24h后的皮肤进行检测,发现TGF-β1 mRNA与未照射组比较明显下调,免疫组化显示成纤维细胞中TGF-β1蛋白水平明显减少,说明TGF-β1的表达在皮肤老化和UV照射导致的皮肤光老化发生过程中有着重要的作用[9]。TGF-β1干预UVA照射皮肤成纤维细胞,与单独UVA照射比较,Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成和表达明显增加[5],说明TGF-β1对UVA照射的皮肤成纤维细胞起保护作用,但对于其胶原减少的原因还没有具体的研究。研究证明皮肤反复暴露于紫外线中,MMP表达增强,真皮胶原基质降解是皮肤光老化的主要原因之一。皮肤成纤维细胞是皮肤MMP产生的主要细胞来源,同时MMP-1、MMP-3在光老化皮肤中高表达[10]。是否TGF-β1是抑制MMP-1、MMP-3的表达导致胶原的减少,未见这方面的报道。

为探讨UVA照射情况下,TGF-β1对成纤维细胞表达MMP-1、MMP-3的有无抑制作用。我们照射前给予TGF-β1预处理,随着TGF-β1剂量增加,皮肤成纤维细胞的增殖活性与单独UVA照射组比较有明显提高,差异有统计学意义,MMP-1、MMP-3mRNA表达降低,呈剂量依赖关系。说明给予一定剂量的TGF-β1能抑制MMP-1、MMP-3mRNA的表达, MMP-1、MMP-3的分泌减少,从而达到减少了对Ⅰ型、Ⅲ型胶原降解,这说明TGF-β1能不同程度的抑制UVA照射体外培养成纤维细胞 MMP-1、MMP-3mRNA的表达,通过拮抗UVA诱导MMP-1、MMP-3 mRNA表达,减少其对Ⅰ型、Ⅲ型胶原降解,达到保护UVA照射体外培养成纤维细胞的作用,起到抗光老化作用。

[参考文献]

[1]GilchresL BA,Garmvs M,Yaar M. Aging and photoaging effect gene expression in cultured human keratinocyte[J]. Arch Dermatol,1994,130(1): A2-A6.

[2]Fisher GJ,Kang S,Varani J,et al.Mechanisms of photoaging and chronological skin aging[J]. Arch Dermatol,2002,138(11):1462-1470.

[3]Uria JA,Jimenez MG,Balbin M,et al.Differential effects of Transforming growth factor-beta on the expression of collagenase-1 and collagenase-3 in human fibroblasts[J]. J Biol Chem,1998,273:9769-9777.

[4]Brenneisen P,Wlaschek M,Wenk J,et aI. Ultraviolet-B induction of interstitial collagenaseand stromelyin-1 occurs in human dermal fibroblasts via an autocrine interleukin-6-dependent loop[J]. FEBS Lett,1999,449(1):36-40.

[5]王继华,刘 垠,何永静,等.TGF-β1对UVA照射皮肤成纤维细胞Ⅰ型,Ⅲ型胶原合成和表达的影响[J]. 中国美容医学,2009,18(3):338-341.

[6]骆 丹,闵 玮,林向飞,等.紫外线照射对皮肤成纤维细胞影响的实验研究[J].中华皮肤科杂志,2004,37(7):428-431.

[7]Massague J. TGF-beta signal transduction[J]. Annu Rev Biochem,1998: 67: 753-791.

[8]Yin L, Morita A, Tsuji T.Tobacco smoke extract induces age-related changes due tomodulation of TGF- beta[J]. Experimental Dermatol,2003:12 (Suppl.2): 51-56.

[9]Gambichler T, Skrygan M,Tomi NS,et aI.Significant downregulation of Transforming growth factor-beta signal transducers in human skin following ultraviolet-A1 irradiation[J]. Br J Dermatol,2007,156(5):951-956. Epub 2007 Mar 23.

[10]王曦.成纤维细胞与皮肤老化[J].中国美容医学,2005,14(2):243- 245.

[收稿日期]2009-07-15 [修回日期]2009-12-09