时间：2022-09-16 11:46:00
研究不同提取方法对灵芝（Ganoderma lingzhi）子实体中三萜酸提取率的影响，结果表明，采用乙醇回流法所得三萜酸的提取得率最大，影响提取的关键因素为液料比、提取时间和提取次数； 采用BoxBehnken设计及响应面分析法对这3个因素进行优化，并通过回归拟合，建立了预测灵芝三萜酸提取的多项式模型， 可预测灵芝子实体中三萜酸提取率的回归模型如下：Y=0.33+0.003125X1+0.021X2-0.014X3+0.0005X1X2-0.019X1X3-0.005X2X3-0.044X12-0.040X22-0.032X32。经响应面最优分析，获得3个因素的最佳水平为：液料比25∶1，提取时间2 h，提取次数3次。经实际试验验证，在该条件下，灵芝子实体三萜酸提取率可达0.335 mg/g，与预测值相比，实测值低1.18%。稳定性试验结果表明，在较低温度下（25 ℃以下），三萜酸化合物较稳定；但在50 ℃及以上温度条件下，三萜酸存在明显的降解现象，三萜酸的稳定性与温度及保藏时间呈负相关。
灵芝子实体； 三萜酸； 提取方法； 化合物稳定性
现代药理学和化学研究表明，多糖和三萜是灵芝（Ganoderma lingzhi）的关键药效成分[15]。三萜酸是指弱酸性三萜化合物，如灵芝酸、赤芝酸、灵芝烯酸、赤芝孢子酸、丹芝酸等三萜成分，是灵芝三萜的主要活性组分。现代药理学研究揭示灵芝三萜酸具有抗肿瘤[67]、抗艾滋病病毒HIV1[8]、抑制真核DNA聚合酶[9]、抑制前列腺增生[1011]、止痛、镇静、解毒保肝、抗菌消炎等功能[1，5]。但现阶段市场上的灵芝产品大多仍以灵芝子实体、孢子粉或其粗提物为主，灵芝重要药效成分的较纯产品，如灵芝三萜或三萜酸的产品仍较少，而且纯的灵芝三萜单体的价格十分昂贵[12]。笔者旨在探索一种高效、实用的灵芝三萜酸提取方法，并对其产品的保藏稳定性进行分析，为今后纯化灵芝三萜酸以及规模化开发较纯的灵芝三萜酸产品提供技术依据。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
灵芝（G. lingzhi）子实体购于浙江省龙泉市凤翠灵芝专业合作社，置于60 ℃烘箱烘干、切片，粉碎成灵芝粉末（絮状）待用。
熊果酸标准品为美国Aladdin阿拉丁试剂（上海）有限公司产品；香草醛为上海国药集团化学试剂有限公司产品；无水乙醇，香草醛，冰乙酸，高氯酸，氯仿，碳酸氢钠均为国产分析纯。
1.2不同溶剂提取灵芝子实体中的三萜酸
精确称取5.000 g灵芝子实体粉末4份，按液料比30∶1分别加入无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯和氯仿，在微沸状态下回流提取3 h，再加20倍量的相同溶剂回流提取2 h，合并2次提取液，分析三萜酸提取得率。
1.3不同提取方法试验
精确称取5.000 g灵芝子实体粉末4份，分别采用超声波法、浸提法、摇床振荡提取法、回流提取法进行提取，比较提取率；各方法的提取工艺及所用溶剂的量由预试验确定。
1.4BoxBehnken试验设计及响应面优化试验
在无水乙醇预提取试验的基础上，微沸回流提取时，温度为77～78 ℃，结合预试验中对三个因素基本水平范围的试验结果，进一步采用BoxBehnken设计各因素的优化试验方案[13]，各因素及水平见表1。结果的优化分析采用响应面分析法。
1.5三萜酸定量分析
三萜酸的定量分析采用比色法[1314]，以三萜化合物熊果酸作为标准品。
1.6三萜酸对温度的稳定性分析
将三萜酸提取物溶于6 mL 100%甲醇溶液，置于具塞试管中。分别在4、25、50、75、100 ℃的温度下放置0～300 min，每隔60 min取样（每次取3个平行样，每个平行样取0.2 mL），分析三萜酸含量的变化。
稳定性试验前后三萜酸含量的变化用试验后样品中三萜酸的相对含量（P）表示：
P=m1m2×100%
式中，m1和m2分别为试验前后样品中的三萜酸含量。
试验设三次重复，结果以平均值±标准偏差表示[14]。
2 结果与分析
2.1不同溶剂对三萜酸提取率的影响
不同极性的溶剂对灵芝子实体中三萜酸的提取率影响如图1所示。在提取条件相同的情况下，溶剂对子实体中三萜酸的提取率大小顺序为：无水乙醇正丁醇乙酸乙酯氯仿，因此，选择无水乙醇作为提取溶剂。
2.2不同方法提取率比较
在确定提取溶剂后，以乙醇为溶剂，4种提取方法对三萜酸提取效果的影响如表2所示。提取方法对三萜酸的提取率影响显著。其中，回流法所得三萜酸提取率远大于另外三种提取方法。因而，适宜子实体中三萜酸的提取方法为回流提取法。
2.3BoxBehnken试验设计优化结果
2.3.1BoxBehnken设计试验结果
按照表3中的BoxBehnken试验方案进行17组实验，各组的三萜酸提取率见表3。
采用DesignExpert V8.0.6分析软件对表3所示试验结果进行二次多项回归拟合分析和方差分析，分析结果如表4所示。
由表4可知，此模型达到极显著水平（P
、X2、X3分别为液料比、提取时间、提取次数的编码值。
2.3.2最优值分析结果
X1、X2、X3三因素之间的交互作用对灵芝子实体中三萜酸提取率影响的响应等高线如图2～4所示。其分别表示液料比、提取时间、提取次数为优化值时，其它两个因素与响应值关系的三维坐标图，直观地反映了各个因素对响应值的关系。
从图2-4可知，不同因素之间的交互效应不同，在所选的两因素范围内响应面图存在最高点，即灵芝子实体三萜酸提取率的极值。根据建立的数学模型进行参数最优分析，得到预测最佳工艺条件：液料比25.47∶1，提取时间2.13 h，提取次数2.74次，此时灵芝子实体中三萜酸提取率理论值可达0.339 mg/g。
图2 液料比与提取时间的交互作用对灵芝子实体
三萜酸提取率影响的响应等高线
Fig.2 Contour map of triterpenoid acid yield versus
ethanol∶fruit body ratio and extraction time
图 3 液料比与提取次数的交互作用对灵芝子实体
三萜酸提取率影响的响应等高线
Fig.3 Contour map of triterpenoid acid yield versus
ethanol∶fruit body ratio and extraction frequency
图 4 提取时间与提取次数的交互作用对灵芝子实体
三萜酸提取率影响的响应等高线
Fig.4 Contour map of triterpenoid acid yield versus
extraction time and extraction frequency
2.3.3验证试验
为了便于实际操作，将上述获得的理论最佳提取条件修订为液料比25∶1，提取时间2 h，提取次数3次。采用优化后的提取条件检验上述模型的有效性和优化结果的准确性。三次试验的平均提取率为0.335 mg/g，回归模型预测最大值为0.339 mg/g，实测值比预测值低1.18%，在误差允许的范围之内，说明该模型能很好的反应试验情况，此模型结果可应用于实践。
2.4温度对灵芝子实体三萜酸稳定性的影响
以三萜酸相对含量为指标，考察灵芝子实体三萜酸在不同温度下的稳定性变化规律，结果如图5所示。图中显示，随着温度的升高，样品中三萜酸的相对含量降低，降解程度随之升高。在4 ℃和25 ℃下，在各保藏时间段，保藏前后三萜酸的含量均没有显著变化。在较高温度下，三萜酸的稳定性与温度和保藏时间成负相关。如在50、75、100 ℃下，三萜酸在保藏后其含量均明显下降；且随着保藏时间的延长，下降幅度加大。在同样保藏时间下，温度越高，三萜酸的降解量越大，稳定性越差。其中，保藏5 h后，在50 ℃下，三萜酸降解了约4%；在75 ℃下，降解了约8%；而在100 ℃下，三萜酸的降解量达到15%。
图5 灵芝子实体三萜酸对温度及相应保藏时间
的稳定性影响
Fig.5 Effect of different temperaturetime regimes on
the stability of triterpenoid acids （TA） from G. lingzhi
3 讨论
灵芝三萜酸是灵芝中除多糖外的另一类重要药效成分，具有广阔的市场开发前景，目前已成为国内外研究的热点[15]。
在灵芝三萜的提取方面，目前大多方法采用溶剂浸提或回流提取。近年来，与传统的溶剂提取法等相比，超声波法辅助提取能显著提高一些产物的提取效率[1618]。笔者以乙醇为溶剂，比较了超声波法辅助提取、振荡提取和回流提取等提取方法对灵芝子实体中三萜酸的提取效率。结果显示，超声波法和振荡提取法并不能提高灵芝子实体中三萜酸的提取得率，而回流提取法的得率最高。姚松君等[18]比较了乙醇浸提和超声辅助提取对灵芝子实体三萜酸得率的影响，结果发现超声辅助提取的得率较高，但没有对乙醇回流方法进行试验。另外，笔者在样品处理时，也尝试了用纤维素酶对子实体材料进行预处理然后提取，但结果并不能显著提高子实体中三萜酸的提取得率。因此，仍以经典的回流提取法作为灵芝子实体中三萜酸的提取方法，该结果与笔者以前报道的灵芝菌丝体中三萜酸提取的方法筛选结果一致[13]。但区别是适宜子实体三萜酸提取的液料比（25∶1）大于菌丝体提取的液料比（11∶1），且提取总次数（3次）也多于菌丝体中三萜酸的提取总次数（2次）。原因可能是子实体的纤维素、木质素和半纤维素的含量高于细胞培养所得的菌丝体中的相应含量，导致提取难度加大。
此外，已有灵芝三萜的提取大多以灵芝总三萜为提取对象，其三萜产物多为乙醇粗取物[1820]，但对灵芝三萜酸的提取研究相对较少。本文以三萜酸为提取目标，对乙醇提取后的三萜粗提物进行了三萜酸化合物的进一步富集和浓缩，通过用氯仿反提取乙醇提取物中的粗三萜，再用饱和NaHCO3萃取氯仿层三萜中的酸性三萜化合物，然后将提取液进行弱酸化（调pH至2～3）后，再用氯仿反萃取其中的灵芝三萜酸化合物。三萜酸提取率为0.335 mg/g，得率较低。今后仍需要进一步对三萜酸的提取工艺进行改进和优化，以提高子实体中三萜酸的得率，为灵芝子实体中三萜酸的规模化开发利用提供参考。
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