2细胞株凋亡的实验研究'> 威灵仙皂苷诱导MR2细胞株凋亡的实验研究

摘要：目的：研究威灵仙皂苷是否能够诱导早幼粒细胞白血病耐药细胞株MR2细胞凋亡。

方法：WST1法观察威灵仙皂苷对MR2细胞的增殖抑制作用；用流式细胞仪观察MR2细胞的凋亡率。

结果：威灵仙皂苷可明显抑制MR2细胞的增殖，诱导MR2细胞凋亡，且呈时间浓度依赖性。

结论：威灵仙皂苷能够明显抑制早幼粒细胞白血病耐药细胞株MR2增殖和诱导MR2细胞凋亡，呈时间浓度依赖性；高浓度威灵仙皂苷对MR2细胞的效果与亚砷酸无统计学差异。

关键词：威灵仙皂苷 MR2细胞 细胞凋亡

【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2013）06-0009-02

随着全反式维甲酸和砷剂的广泛使用，急性早幼粒细胞白血病（APL）的预后已经得到明显改善。但是对全反式维甲酸耐药以及砷剂长期使用后的毒副作用仍然不利于患者的长期生存，因此仍然需要安全、有效、经济的方法，治疗全反式维甲酸耐药APL患者。威灵仙是一味价廉物美的中药，主要用于治疗风湿性骨痛，腰背痛。研究发现其发挥作用的主要成分是皂苷，且已有报道其有明显的抗恶性肿瘤的效果[1]。本研究选择APL耐药细胞株MR2为研究对象，初步探讨威灵仙皂苷对APL耐药细胞的凋亡作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株：耐全反式维甲酸急性早幼粒细胞白血病细胞株（MR2细胞）引自四川大学华西医学院。

1.2 实验试剂：威灵仙皂苷（在泸州医学院药研所）自行提取[1]；二甲基亚砜DMSO购于Sigma公司；WST1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购于江苏碧云天生物技术研究所；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司；亚砷酸购于黑龙江哈尔滨医大药业有限公司（10mg/支）。

1.3 细胞培养：将MR2细胞接种于RPMI1640培养液中，置于50ml/L CO2、饱和湿度、37℃恒温孵箱中悬浮培养，每2-3d换液传代。

1.4 WST-1法检测威灵仙皂苷对MR2细胞的增殖抑制作用：选择对数期生长期MR2细胞，将细胞调整为浓度为1×104个/ml并接种于96孔酶标板，每孔加细胞悬液100ul，共设8个实验组（每组5个平行孔，实验重复三次），以终浓度0.01%DMSO为空白对照组，终浓度1.0umol/l亚砷酸为阳性对照组，终浓度200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml威灵仙皂苷为实验组。分别培养24h、48h、72h后。每孔加入10ul WST-1溶液，继续在细胞培养箱孵育2h后。在450nm测定，按以下公式计算抑制率。

细胞增殖抑制率（%）=（1-A实验组A对照组）×100%

1.5 流式细胞仪检测凋亡率：调整细胞浓度为1×106个/ml接种于六孔板，设五个实验组（每组设三个平行对照，实验重复三次），以终浓度0.01%DMSO为空白对照组，终浓度1umol/ml亚砷酸为阳性对照组，终浓度800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml威灵仙皂苷为实验组。分别培养72h。用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.6 统计学分析：实验数据计算均值、标准差，各组应用方差分析，以a=0.05为检验水准，P

2 结果

2.1 威灵仙皂苷对MR2细胞有明显的生长抑制作用：不同浓度的威灵仙皂苷对MR2细胞均有明显的生长抑制作用，且呈时间和浓度依赖性。统计学分析表明，亚砷酸阳性对照组与皂苷实验组总的差异有统计学意义（见表1）。

2.2 流式细胞仪。Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡：分别用亚砷酸组与皂苷800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml组作用MR2细胞72小时后应用流式细胞仪检测凋亡率为（见表2）：统计学分析：亚砷酸组与皂苷1200ug/ml组之间差异无统计学意义；亚砷酸组和皂苷1200ug/ml组与皂苷800ug/ml、1000ug/ml组间差异有统计学意义；皂苷800ug/ml组与皂苷1000ug/ml组间差异有统计学意义。

3 讨论

威灵仙是一味价廉物美的中药，近年来大量研究证明，其主要成分皂苷具有良好的抗肿瘤作用[1]。如人参皂苷抗肿瘤机制主要通过调控肿瘤细胞增殖周期、诱导细胞分化和凋亡来发挥抗肿瘤作用[2]；九节龙皂苷通过抑制肿瘤细胞生长来抗小鼠肝癌和黑色素瘤[3]。提示皂苷有很好的研究和开发前景。但其抗白血病的作用和机制还未见报道。MR2细胞株来源于APL细胞株NB4细胞对ATRA耐药的细胞克隆，可表达PML-RARa融合蛋白，其重组蛋白配体结合功能区活性下降或丧失[4]。该细胞株可用于筛选新分化诱导剂和APL耐药机制的研究。在实验中我们通过WST-1证明威灵仙皂苷可明显抑制MR2细胞的生长增殖，用流式细胞仪定量、定性的证明威灵仙皂苷能够诱导MR2细胞凋亡。且WST-1和流式细胞仪的数据表明高浓度的威灵仙皂苷的增殖抑制率和凋亡率与亚砷酸组的差异无统计学意义，这意味着高浓度的威灵仙皂苷对MR2细胞的增殖抑制作用、凋亡作用与亚砷酸是一致的。总之，我们的研究显示威灵仙皂苷对MR2细胞有明显的诱导凋亡作用，但具体的作用机制有待进一步研究明确。

本实验证实，威灵仙皂苷具有抑制急性早幼粒细胞白血病MR2细胞株增殖及诱导其凋亡的作用，为临床威灵仙皂苷用于抗肿瘤治疗提供一定的理论依据。

参考文献

[1] 徐先祥，夏伦祝.大孔吸附树脂分离纯化威灵仙总皂苷的工艺研究.中药新药与临床药理，2006，17（1）：57-59

[2] 赵越，苏适.人参皂苷Rh2抗肿瘤作用的研究[J].微生物学杂志，2003，23（2）：61-63

[3] 李伟芳等.九节龙皂苷体内的抗肿瘤作用.广西中医药研究所.中国医药学报.2003；（18）60