针刺对溶栓治疗急性脑梗塞患者D二聚体的影响

孟庆刚　孔庆爱　唐　强　高兵兵　张宁指导:于致顺

(大连大学医学院,辽宁116622;大连市中医医院;黑龙江中医药大学附属二院)

摘　要　选择107例急性脑梗塞患者,根据发病时间顺序按随机表将其分为8组。采用D-二聚体为指标,进行治疗前后连续性检测。结果:早期针刺组中D-二聚体的改善程度均优于其它各组(P

主题词　脑梗塞/针灸疗法　血栓溶栓疗法　D-二聚体

针刺治疗急性脑梗塞疗效确凿。近年来,临床发现针刺对溶栓治疗急性脑梗塞有积极的促进作用。以往的研究资料表明:D-二聚体检测是一项鉴别原发性纤溶和继发性纤溶以及监测溶栓治疗的有价值的指标。因此,笔者利用自制单克隆抗体,建立酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法检测血浆D-二聚体含量,观测针刺对溶栓患者D-二聚体的影响,以进一步证实针刺在促进纤溶过程中的作用。

1　一般资料

1.1　研究对象

观察组A自1996年5月～1997年10月选取了107例发病在24 h以内的经CT证实确诊为急性脑梗塞(颈内动脉系)住院患者,男67例,女40例;年龄35～75岁,平均53.6岁。按入院先后顺序分为发病12 h以内组B1(含12 h)、和大于12 h组B2(含24 h)。然后再将12 h以内组病人随机分为早期针刺溶栓组(A1B1)13例,早期溶栓组(A2B1)11例,早期常规治疗组(A3B1)13例,早期针刺常规治疗组(A4B1)12例;同理,将大于12 h B2组病人随机分为针刺溶栓组(A1B2)16例,溶栓组(A2B2)14例,常规治疗组(A3B2)13例,针刺常规治疗组(A4B2)15例。拟以溶栓组(A2)、常规治疗组(A3)、针刺常规治疗组(A4)为针刺溶栓组(A1)的对照组。以上各组病人,均由神经内科医师根据临床评分、CT、病理和实验室检查结果诊断,符合有关诊断标准。

对照组C正常组C1(40例),健康中青年男女各半;年龄20～50岁,平均43岁。均为医院健康献血员。老年人组C2(20例),健康老年人男12例,女8例;年龄51～75岁,平均57.7岁。均经体检排除高血压、冠心病、高血脂、糖尿病,无烟、酒嗜好,近2周内无服药史。

1.2　观测指标D-二聚体单抗的制备

纯化抗原:在200 mg纯纤维蛋白原(Fg)中,分别加入5 mmol/L的CaCl2,50 U的纯凝血酶,4 mg的因子XⅡ,0.15 mol/L的NaCl,0.1 mol/L Tris,使pH=7.4于37 ℃温育18 h后,再分别加入1.2 mg纯纤溶酶,500 U的尿激酶,静置18 h后,用0.01 mol/L的Tris缓冲液透析,pH=8.6。然后用DEAE-52层析,SDS电泳分析,将D-二聚体部分合并。用PEG透析浓缩后再次分离,得到纯度较高的D-二聚体作为抗原。

单抗制备:选用8周龄雄性BALB/C小鼠,用福氏完全佐剂加20 μg D-二聚体纯抗原,常规腹腔注射,免疫2次,间隔4、8周,再用20 μg D-二聚体抗原加强免疫,4天后杀死小鼠,取脾做细胞融合,2周后待细胞克隆长到约为培养孔的1/8时,用抗原进行筛选,得到8个特异性D-二聚体单抗株。

1.3　研究方法

(1)ELISA法的建立

采用双抗体夹心法。用1株自制D-二聚体单抗,包被于聚丙乙烯塑料板,另1株单抗标记辣根过氧化物酶,经交叉配对试验,找到2株能够用于D-二聚体的捕捉法测定,此即ELISA双抗体夹心法。

(2)D-二聚体检测方法

血浆准备:取患者静脉血,用0.13 mol/L檬酸钠1∶9抗凝,3000 r/min,低温离心,分离血浆,于-20 ℃下保存待检。

检测方法:在包被单抗的酶标反应板上,加入待检样品和不同稀释度的标准品,37 ℃温育1 h后,洗4次,再加入酶标记的单抗,37 ℃温育30 min后,洗4次,再加OPD底物显色,37 ℃温育15 min,加2 mol/L硫酸中止反应。最后在492 nm波长下比色,根据曲线求得D-二聚体含量,单位是mg/L血浆。

(3)治疗方法

针刺溶栓组A1:包含B1、B2两组,入院后即针刺同时检测指标,然后再静脉溶栓。

溶栓方法:采用南京大学制药厂生产的尿激酶50～75万U,加入0.85% NaCl 250 ml,每日1次静滴,1～1.5 h滴完,连用3天。用药前常规检查出凝血时间、血小板,没有出血倾向时可用。同时口服维生素C 300 mg,维生素E 100 mg,每日3次;用药第2天给肠溶阿斯匹林40 mg,每日1次口服。3天后用精制蝮蛇抗栓酶2.0 U加入0.85%NaCl 250 ml每日1次,静滴1周,然后改用改善脑代谢药物如ATP40 mg、辅酶A 100 U、胞二磷胆碱0.75 g,每日1次,连用10天。脑水肿严重者给20%甘露醇250 ml,每日2～4次静滴。

针刺取穴:前神聪透悬厘穴(病灶侧),百会透曲鬓穴(双侧)。

针刺方法:常规消毒后,用0.40 mm×50 mm毫针,按上述穴区分3段透刺,针体与皮肤呈15度角,至帽状腱膜下,深约40 mm。针后捻转200次/min,每根针捻转2 min,留针8 h。其间,开始每隔30 min捻转1次,重复2次,然后每2 h捻转1次,直至出针。每日1次,10次为一疗程。

溶栓治疗组A2:包括B1、B2两组,入院后先检测指标,然后开始静脉溶栓(方法同A1组)。

常规治疗组A3:包括B1、B2两组,入院后先检测指标,然后开始常规治疗。

口服:维生素C、维生素E、肠溶阿斯匹林,剂量同A1组。静脉点滴精制蝮蛇抗栓酶2.0 U加入0.85%NaCl 250 ml,每日1次,连用10天。然后改用能量合剂(ATP)40 mg、辅酶A 100 U、胞二磷胆碱0.75 g,每日1次,用法同前。重证处理同前。

针刺常规治疗对照组A4:包含B1、B2两组,入院后即针刺(方法同A1组),同时检测指标,然后进行常规治疗(同A3组)。

1.4　统计学分析

由于本题采用系统分析方法进行分组,因此,所测各项定量指标均值采用系统方差分析,并进行两两组间对比。因需要在不同时间点上测得某指标,以观察针刺在溶栓灌注各个时间点上的作用,则用具有一个重复测量的多因素方差分析。以上各种分析均用美国SAS公司的数理统计软件包(6.12版)在686PC机上进行。

2　结果

血浆D-二聚体的正常参考值,各家报道不一。本题测值如表1。 由此可知,随着年龄的增高,D-二聚体也逐渐偏高,体内处于相对高凝状态,这与以往文献报道一致。观察组结果见表2～表5。

以上表明:本题所研究的D-二聚体范围,如表1、表5所示。

治疗前、后所有病人的D-二聚体值均高于正常参考值,两两相比,差异有非常显著性意义(P0.05),见表4,说明B1、B2各组间具有可比性。

针刺溶栓组与溶栓组的D-二聚体在溶栓5 h后,与治疗前相比增高非常显著(P

3　讨论

D-二聚体(D-dimer)是纤维蛋白单体(fibrin monomer)经活化因子ⅩⅢ(F ⅩⅢa)交联后,再经纤溶酶(Plasmin)水解所产生的一种特异降解产物。利用Latex和酶联免疫吸附试验(ELISA)法,可以分别定性和定量测血浆和尿液中D-二聚体的含量。定性阳性或定量增高反映纤溶活性增强和凝血酶生成增多,是一项鉴别原发性纤溶和继发性纤溶以及监测溶栓治疗的较有价值的指标。在凝血过程中,凝血酶水解纤维蛋白原先后释放出纤维蛋白肽A(FPA)和肽B(FPB),剩余部分为可溶性纤维蛋白单体(SFM),在因子ⅩⅢa作用下,SFM转变为纤维蛋白,从而血液凝固。此过程是因子ⅩⅢa(转谷酰胺酶)在谷氨酸(397)与赖氨酸(405)处形成ε-(γ-谷氨酸-赖氨酸)交联。这种交联首先发生于两条端与端聚合的纤维蛋白单体的γ链之间,其次发生于α链和α链之间,然后才发生在γ-α链之间。通过上述交联后所形成的纤维蛋白很稳定,一般不再溶解。纤溶酶除了可以降解纤维蛋白原和SFM外,也可降解交联的纤维蛋白。交联纤维蛋白在纤溶酶的降解过程中,逐渐生成X′、Y′、D和E′碎片以及DD、DD/E、YD/DY和YY/DD等多聚体,其中最简单的降解产物是D-二聚体和DD/E复合体。血浆D-二聚体作为交联纤维蛋白的特异降解产物,其水平的增高反映继发性纤溶活性的增强,可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物之一。因此,它对高凝状态和血栓性疾病的诊断、疗效观察和预后判断有重要意义。

血浆D-二聚体作为交联纤维蛋白的特异降解产物,其水平的增高与否,直接反映着继发纤溶活性的状况,是体内高凝状态和纤溶亢进的特异性指标之一。

以往的实验提示,D-二聚体在应用药物后,一般5 h方达到高峰。选择治疗后5 h为观测点。

血浆D-二聚体的水平在脑血管疾病时变化不一。Greenberg等报道,在急性缺血性中风发病1周内,血浆D-二聚体水平略有升高,2周后则持续增高。Ono等人发现,血浆D-二聚体的水平与年龄有关,大于75岁(含75岁)的中风患者与正常对照组比较差异显著,而低年龄组中风患者则差异不明显。本题测定107例脑血管疾病患者的血浆D-二聚体水平,较正常对照组有明显升高(P

4　结论

(1)本题之所以选择D-二聚体作为溶栓的特异性指标是因为尿激酶能激活纤溶酶原,使纤溶酶原转化成纤维蛋白溶解酶,后者可使交联纤维蛋白降解,产生纤维蛋白降解产物(FDP),从而溶解血栓。然而,纤维蛋白溶解酶除了使纤维蛋白降解外,还可使纤维蛋白原降解产生FDP,故此FDP升高并不一定表示有血栓的形成或溶解。交联纤维蛋白特异性降解产物D-二聚体的检测为血栓形成及溶栓疗效的判断解决了难题。从本题检测结果可知D-二聚体含量的多少对针刺加溶栓疗效的判定有重要意义。

(2)本题研究还表明:早期溶栓+针刺组中各项指标的改善程度均优于本题中其它各组(P