梨Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列的克隆及分析

摘要：根据Ty1—copia类逆转座子逆转录酶的保守区设计简并引物，从10份梨属（Pyrus）材料中扩增该逆转座子片段。扩增产物经纯化后克隆于pMD18—T质粒载体，选择阳性克隆，再经菌落PCR鉴定、测序及序列分析，获得了14条梨Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列。这些核苷酸序列长度为250～267 bp，具有较高的异质性，主要表现为缺失突变，通过核苷酸聚类可将14条序列分为4个家族。对这些片段的氨基酸序列进行分析，结果显示有2个序列发生了终止密码子突变。该研究获得的梨属植物Ty1—copia类逆转座子逆转录酶氨基酸序列与已报道的其他生物的相应序列有较高的一致性。

关键词：Ty1—copia类逆转座子逆转录酶；梨（Pyrus）；克隆；序列分析

中图分类号：S661.2 文献标识码：A 文章编号：0439—8114（2012）19—4388—03

逆转座子（Retrotransposon）是真核生物中种类最多、分布最广的转座因子，也是高等植物核基因组的重要组成部分[1]。各种生物和非生物因子的胁迫都可能诱导逆转座子发生转座，导致基因突变、基因组扩增及重排等，造成植物的遗传变异，从而成为自然选择的源泉[2—5]，其序列的克隆与分析研究对于植物基因组组成、进化与基因的表达调控研究均有重要的意义。迄今已在苹果[6，7]、柑橘[8]、柿[9]、葡萄[10]等主要果树作物中研究分析了逆转座子的种类和组成。其中Ty1—copia类逆转座子在植物界广泛分布，是研究最多的一类[3—5]。目前关于梨逆转座子的报道较少，该研究依据Ty1—copia类逆转座子逆转录酶的保守序列设计简并引物，采用PCR方法进行梨属植物Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列的分离克隆，并通过序列分析初步研究其变化特点，以期为梨属植物的逆转座子研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究材料包括2个西洋梨（Pyrus communis L.）品种早红考密斯和康福伦斯，2个砂梨（P. pyrifolia Nakai.）品种丰水和蒲瓜梨，2个白梨（P. bretschneideri Rehd）品种雪花梨和鸭梨，2个秋子梨（P. ussuriensis Maxim）品种安梨和花盖梨，以及两个砧木种杜梨（P. betulaefolia Bge.）和豆梨（P. calleryana Dcne.），共10份材料。

1.2 方法

1.2.1 梨基因组DNA的提取及Ty1—copia类逆转座子逆转录酶的扩增 取刚展开的嫩叶，采用CTAB法[11]提取基因组DNA，并用紫外分光光度计测定DNA浓度。参照文献[12]设计Ty1—copia类逆转座子逆转录酶的引物，上下游引物序列分别为：5′—ACNGCNTTPyPyTNCAPyGG—3′，5′—APuCATPuTC

PuTCNACPuTA—3′，其中N=A+T+C+G，Py=A+G，Pu=T+C。PCR反应体系为：DNA 20 ng，dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.3 μmol/L，2.0 μL 10×Buffer，2.5 mmol/L Mg2+，1 U Taq DNA聚合酶（上海Sunny公司生产），加双蒸水至20 μL。PCR扩增程序为：94 ℃ 120 s；94 ℃ 30 s，53 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 5 min。反应在Bio—Rad S1000型PCR仪上完成。

1.2.2 PCR产物的回收、克隆及转化 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用TaKaRa凝胶回收试剂盒回收早红考密斯的PCR扩增产物。回收产物经纯化后连接于pMD18—T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37 ℃培养16～20 h后蓝白斑筛选，挑取白色单克隆，在含有100 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜后PCR鉴定阳性克隆。

1.2.3 Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列测定及序列分析 将鉴定为阳性的菌液送往北京六合华大基因科技股份有限公司测序。利用DNAStar和DNAMAN软件对获得的逆转录酶序列进行分析。

2 结果与分析

2.1 Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列的PCR扩增结果

采用1%琼脂糖凝胶电泳对Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列的PCR扩增产物进行检测，结果如图1，供试的10份梨属植物材料均能扩增出长度约为260 bp的Ty1—copia类逆转座子逆转录酶片段，与之前的报道一致，说明Ty1—copia类逆转座子在梨属植物中普遍存在。

2.2 Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列测定结果

将以早红考密斯基因组DNA为模板扩增得到的Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列进行回收纯化、克隆、测序后，共得到14条序列，全部序列信息已经提交GenBank数据库，登录号为JN639033～ JN639046（表1），这些序列与已知植物的Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列有较高的同源性，说明其逆转座子是真实的。14条序列均富含A、T碱基，其中A、T、C、G碱基的个数分别为55～83、70～99、33～68、44～67，AT与GC比例范围为1.09～1.69。

2.3 Ty1—copia类逆转座子逆转录酶的核苷酸序列和氨基酸序列分析

为了阐明梨Ty1—copia类逆转座子逆转录酶间的相互关系，利用DNAStar对分离到的14条逆转录酶序列进行聚类分析，构建梨该类逆转座子的系统发育进化树（图2）。根据进化树Branch的长度把这14条序列分成4个家族，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ家族各包括4个序列，第Ⅲ家族只有2个序列。14条Ty1—copia类逆转座子逆转录酶核苷酸序列长度为250～267 bp，短于之前报道的273 bp[4]，说明缺失是造成梨Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列长度变化的主要原因。进一步分析表明，Pcrt3在第25、27、32和59个氨基酸处发生了4个终止密码子突变；Pcrt14在第10、55、71和89个氨基酸处也存在4个终止密码子突变（图3），由此推测终止密码子突变可能是逆转座子发生突变及不能表达的主要原因之一。从GenBank中搜索到已登录的其他生物的Ty1—copia类逆转座子逆转录酶的氨基酸序列，与本研究获得的14条梨Ty1—copia类逆转座子逆转录酶的氨基酸序列比对，结果显示本试验所克隆到的梨Ty1—copia类逆转座子逆转录酶氨基酸序列与苹果、草莓、柑橘、桃等的有较高的一致性，表明它们可能有共同的起源[13]，也可能是不同物种间逆转座子横向传递的结果[14]。

3 讨论

本研究首次对梨属植物中的Ty1—copia类逆转座子逆转录酶基因进行了PCR扩增，从10份材料中均扩增出长度为260 bp左右的目标片段，说明Ty1—copia类逆转座子逆转录酶基因在梨属植物中广泛存在。从西洋梨品种早红考密斯中获得了14条Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列，这些序列表现出较大的变异性，其核苷酸序列为250～267 bp，存在缺失突变；其中2个序列发生了4个终止密码子突变，由此推断缺失突变和终止密码子突变可能是造成逆转座子异质性的重要原因。

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