时间：2022-09-15 07:02:19
【摘要】 目的：介绍兔肝VX2瘤模型的制作方法及经验；同时探讨3.0 T MR在监测兔肝VX2瘤生长特性方面的价值。方法：新西兰大白兔23只随机分为3组，采用开腹直视下瘤块接种法，于接种后14 d、28 d及42 d分别行3.0 T MR常规序列、DWI检查并与病理结果对照。结果：16只实验兔发现瘤灶，成瘤率70%；14 d组的VX2瘤体积较小，以28 d组与42 d组瘤体显示更为清晰，瘤体最大直径约2.5～5.0 cm。常规3.0 T MRI图像上，T1WI所有VX2瘤均呈稍低信号，14 d组T2WI呈均匀稍高信号、28 d组与42 d组T2WI部分呈不均匀稍高信号。DWI图像上所有VX2瘤均呈明显高信号，28 d组与42 d组的肿瘤中心可见斑片状低信号。结论：开腹直视下瘤块接种法成瘤率偏低，易受外界多种因素的影响；3.0 T MR DWI在监测VX2瘤的生长特性方面具有重要价值。
【关键词】 兔； 肝脏； VX2瘤； 磁共振
兔肝VX2瘤因与人类原发性肝癌具有相似的血供特征、侵袭方式及淋巴道、血道转移特点，已成为肝癌基础研究中最常用的模型之一。本研究探讨兔肝VX2瘤模型的建立方法，并在建模后的不同时期分别对其行3.0 T MR常规序列及DWI检查，以病理结果作为“金标准”评价VX2瘤的生长特性，从而探寻一种更为经济、实用的肝癌影像检查方法。
1 材料与方法
1.1 材料 新西兰大白兔23只（由泸州医学院实验动物中心提供），雄性15只，雌性8只，体重2.0～3.0 kg。荷瘤兔1只，3%戊巴比妥钠，8%硫化钠，外科无菌手术包，显微剪，PHILIPS 3.0 T-Achieva/intera双梯度超导高场强磁共振扫描仪，8通道膝关节相控阵线圈。
1.2 兔VX2肝癌动物模型的制作方法
1.2.1 瘤株提取 经耳缘静脉推注3%戊巴比妥钠1 ml/kg，麻醉荷瘤兔后，在无菌条件下剥离肿瘤，切取靠近包膜的灰白色鱼肉样肿瘤组织，注意剔除坏死组织及纤维组织，用显微剪将肿瘤组织剪碎成1 mm3左右大小的瘤块，置于盛有生理盐水的无菌弯盘中备用。
1.2.2 种植过程 实验兔全麻（用药及剂量同前），仰卧固定于动物手术台上，手术野常规剪毛，8%硫化钠脱毛，按外科无菌操作程序消毒手术区皮肤，铺无菌手术洞巾。于剑突下约1 cm处沿腹白线作一长约3 cm的上腹正中切口，逐层切开腹壁，暴露肝脏左叶；用食指及拇指轻柔固定肝脏，于其组织较厚处，以显微剪作一长约3 mm的小切口，经切口在肝内潜行分离形成一个约3 mm×5 mm大小的腔隙，将备用的1～2个瘤块植入其中，明胶海绵封闭肝脏切口并按压止血，待无活动性出血后，1号丝线逐层缝合腹壁切口，关闭腹腔。
1.2.3 术后处理 待实验兔复苏后送回动物房中继续饲养，注意保持动物房的干燥、通风。术后3 d常规肌注青霉素40万U及庆大霉素4万U，预防切口感染。
1.3 MR扫描方法及参数 采用PHILIPS 3.0T-Achieva/intera双梯度超导高场强MR扫描仪，8通道膝关节相控阵线圈。实验兔检查前禁食、禁水12 h以上，全麻后（用药及剂量同前）俯卧固定于8通道膝关节相控阵线圈内，先行常规T1WI、T2WI横断扫描，再行DWI扫描。具体扫描参数如下：T1WI（TR 10 ms，TE 2.5 ms，FOV 145×106 mm，NSA 6，层厚3 mm，层间距1 mm，矩阵256×256）；T2WI（TR 3000 ms，TE 80 ms，FOV 145×106 mm，NSA 4，层厚3 mm，层间距1 mm，矩阵256×256）。DWI（TR 6000 ms，TE 47 ms，层厚2 mm，间距0.6 mm，各向同性，NSA 6次平均，FOV 185×185 mm，矩阵128×128；梯度因子b值取600 s/mm2），以上各序列扫描范围均为膈顶至肝脏下缘。
1.4 病理检查 MR扫描完毕后立即采用空气栓塞法处死实验兔，取肝脏原发肿瘤及周围正常肝组织，采用10%中性甲醛溶液固定，48 h后行石蜡包埋切片，HE染色后光镜下观察。
2 结果
2.1 种植结果 23只实验兔中，1只术前麻醉过度死亡，3只在种植后第6、10、12天腹泻死亡，1只吞食金属异物未能完成检查，2只在植瘤后14 d行MR常规扫描时发现植瘤失败的实验兔均被剔除出实验，其余16只建模成功，成瘤率70%。
2.2 3.0T MR检查结果 将成功建模的16只实验兔依照兔肝VX2瘤的一般分期随机分为3组（即14 d组6只、28 d组6只及42 d组4只），在对应的时间内行MR检查。14 d组瘤体最大径约0.5 cm，3.0T MR常规序列及DWI检出7个肝内病灶，其中5只1个病灶，1只2个病灶；28 d组瘤体最大径约2.5 cm，3.0 T MR常规序列及DWI检出9个肝内病灶，其中4只1个病灶，1只2个病灶，1只3个病灶。42 d组瘤体最大径约5.0 cm，3.0T MR常规序列及DWI发现4个肝内病灶及广泛的肝内小转移灶。14 d组的VX2瘤体积较小，以28 d组与42 d组瘤体显示更为清晰。
MRI常规序列图像上，14 d组VX2瘤在T1WI均呈稍低信号，在T2WI呈均匀稍高信号；28 d组与42 d组VX2瘤在T1WI 均呈稍低信号、部分在T2WI呈不均匀稍高信号（图1A、B）。DWI图像上，所有VX2瘤均呈明显高信号，与周围正常肝组织对比鲜明；28 d组与42 d组的VX2瘤中心可见斑片状低信号（图1C）。
2.3 病理检查结果
2.3.1 大体病检 14 d组的VX2瘤呈灰白色，质地均匀，无坏死囊变。28 d组与42 d组的VX2瘤瘤体中心见不规则的斑片状坏死囊变（图2A）；肝内转移见肝内多发大小不等的灰白色结节。
2.3.2 镜检 低倍镜下肝内多发瘤巢，与周围肝实质分界不清，瘤内实质成分较多而结缔组织少，瘤细胞之间可见新生毛细血管（图2B）；高倍镜下瘤细胞体积大、排列不规则，胞核大而浓染，胞质丰富（图2C）。
3 讨论
3.1 兔VX2肿瘤模型的建立 兔VX2肿瘤是由Shop等[1]使用病毒在兔皮肤诱导出的状瘤，经72次传代培养后，建立起来的鳞癌细胞株。兔肝VX2瘤从生长特征、转移及死亡、病理过程均与人类肝癌相似，且模型稳定，复制性强、种植成功率高、成型周期短等特点，易被超声、CT、MRI等发现和检测，可用其进行肝癌的影像学、治疗学及抗肿瘤药物的药代动力学等实验研究，是目前最大、最成熟和最常用的肝癌肿瘤模型[2]。兔肝VX2肿瘤模型一般可分为3个生长时期：实质期（种植后2～3周），坏死期（种植后4～5周），囊变期（种植后6～7周）[3]。
兔VX2肝癌模型的制作方法主要有3种：经肝动脉插管或经皮肝穿刺注射瘤细胞、无菌下开腹瘤块种植。前二者成功率较低，小于70%，后者成功率多大于90%[4-7]。本研究采用开腹瘤块种植的方法，肝内种植成功16只，成瘤率仅70%。究其原因：一方面，经验不足，没有取到活力最强的瘤株；另一方面，术后天气寒冷，兔生活环境潮湿导致3只兔术后腹泻死亡。因此，兔肝VX2瘤的成功种植主要取决于：（1）瘤块的制备，应选择生长2～3周的肿瘤，注意剔除外层纤维组织与中央坏死组织而选择灰白色鱼肉样肿瘤组织。（2）选择恰当的开腹切口与植入口，减小手术创伤；植入瘤块时，尽可能使瘤块种植在肝左叶深部，靠近较大血管支以便获得血供；植入瘤块后，及时用明胶海绵压迫止血。（3）保持兔生活环境的干燥、通风，特别注意防止肠道疾病。此外，还应避免使用体重在1.5 kg以下、3个月龄以下的实验兔，因为其耐受力低，更易患肠道疾病。因此，开腹瘤块种植法建模，易受多种因素的影响，成瘤率偏低。
3.2 不同时期兔肝VX2瘤3.0 T MR表现特征分析 3.0 T MR常规序列基本可以反应肿瘤的生长情况，且在瘤体坏死囊变等不同成分的识别上具有一定优势。DWI是MR功能成像技术，它由不同组织间水分子扩散运动的差异造成的信号衰减来反映组织的结构特性，提供了与以往T1WI、T2WI不同的新的成像方式，是目前唯一能够在活体检测组织内水分子扩散运动的无创性方法[8]。随着MR软硬件技术的发展，回波平面成像（echo planar imaging，EPI）技术及敏感性编码成像（sensitivity encoding，SENSE）技术的出现，使得DWI成功地应用于肝脏等腹部器官[9-11]。VX2瘤为实体性肿瘤，水分子扩散明显受限，因而在DWI上呈明显高信号，与周围正常肝组织的对比鲜明。在MR常规序列及DWI图像上，14 d组所有肿瘤信号均匀，病理检查发现，仅1例出现液化坏死，考虑与实验兔的体质差异及种植位置较靠近肝边缘、血供不足有关。从理论上讲，液化坏死区在DWI上应表现为不同程度的低信号，该例的液化坏死区在DWI上却仍为高信号，肉眼不能分辨其与肿瘤实质的信号差异。这可能与肿瘤早期体积较小，液化坏死为小灶性，受部分容积效应的影响所致。28 d组及42 d组的肿瘤在DWI图像上均出现斑片状低信号区，说明水分子在该区域的扩散受限不明显，病理检查证实为肿瘤内的液化坏死，而常规序列T1WI均未检出，T2WI仅检出7例。因此，3.0 T MR常规序列尚不能及时有效地观察到肿瘤内部的液化坏死，而DWI可敏感检出肿瘤的液化坏死，在反映肿瘤的生长特性方面较常规MR序列更具优势。
参考文献
[1] Shop R E，Hurst E W.Infectious papillomatosis of rabbits：with a note on the histopathology[J].J Exp Med，1933，58（5）：607-624.
[2] Ni Y，Wang H，Chen F，et al.Tumor models and specific contrast agents for small animal imaging in oncology[J].Methods，2009，48（2）：125-138.
[3]梁斌，肖恩华，向军，等.兔肝VX2瘤模型MR灌注成像与MVD及VEGF的相关性研究[J].临床放射学杂志，2007，26（1）：73-77.
[4] Geachwind J F，Artemov D，Abranham S，et a1.Chemoembolization of liver tumor in a rabbit model：assessment of tumor cell death with diffusion-weighted MR imaging and histologic analysis[J].J Vase Interv Rodial，2000，11（10）：1245-1255.
[5] Jia H S，Quan X Y，Zeng S，et al.Dynamic evaluation of rabbit VX2 hepatic carcinoma with CT and MRI[J].Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao，2002，22（2）：141-144.
[6] Matsumua T，Moriyau F，Kono Y，et al.Contrast-enhanced power Doppler imaging of the liver preliminary animal study[J].Nippon Rinsho，1998，56（4）：985-989.
[7]张琳，丁仕义，黄学全.兔VX2肝转移癌模型传代的改进和螺旋CT评价[J].第三军医大学学报，2002，24（9）：1125-1127.
[8]倪明立，王成伟.磁共振DWI在肝癌中的应用[J].放射学实践，2010，1（1）：102-104.
[9] Bammer R.Basic principles of diffusion-weighted imaging[J].Eur J Radiol，2003，45（3）：169-184.
[10] Kwee T C，Takahara T，Ochiai R，et a1.Diffusion-weighted whole-Body imaging with background body signal suppression （DWIBS）：Features and potential applications in oncology[J].Eur Radiol，2008，18（9）：1937-1952.
[11] Naganawa S，Kawai H，Fukatau H，et al.Diffusion-weighted imaging of the liver：technical challenges and prospects for the future[J].Magn Reson Med Sci，2005，4（4）：175-186.
（收稿日期：2013-08-26） （本文编辑：欧丽）