参附注射液对大鼠全脑缺血再灌注时核因子-κB表达的影响

【中图分类号】 R977 【文献标识码】 A 【文章编号】1185-1672(2007)-04-0291-03

摘要 目的 探讨参附注射液(Shenfu Injection)对大鼠全脑缺血再灌注时核因子-κB（nuclear factor kappaB ,NF-κB）表达的影响及其治疗作用。方法 采用四血管阻塞的方法，复制出大鼠全脑缺血再灌注模型。采用免疫组化法、原位杂交法和原位末端标记法分别检测假手术组(A组)、全脑缺血再灌注组(B组)、参附注射液治疗组(C组)海马CA1区NF-κB 、肿瘤坏死因子－αmRNA(TNF－αmRNA)及细胞凋亡数的变化。结果 与假手术组比较，全脑缺血再灌注组海马CA1区NF-κB 和TNF－αmRNA 的表达及细胞凋亡数明显增加(P

关键词 参附注射液；全脑缺血再灌注；核因子－κB；肿瘤坏死因子－αmRNA；凋亡

脑缺血再灌注损伤的机制尚未完全阐明，目前，认为缺血再灌注后的炎症反应可能是其重要机制之一。NF-κB是目前发现的与炎症有关的重要转录因子之一，参与多种细胞因子和炎症介质的转录调节。TNF-α是重要的前炎症细胞因子，在脑缺血再灌注的炎症反应中起非常重要的级联放大作用。参附注射液是全国中医医院急诊科（室）必备中成药，它是由红参、附片提取而成，主要有效成分别为人参皂苷和乌头碱，具有回阳救逆、益气固脱的临床作用，在脑缺血再灌注的动物实验中研究发现其具有抗氧化、改善神经功能等作用［1-3］，但其是否对细胞因子的上游调节因子--核转录因子有调节作用，目前还不清楚。因此，我们通过观察Wistar大鼠全脑缺血再灌注后NF-κB和TNF-α mRNA表达的变化及参附注射液对其干预的影响，探讨参附注射液对全脑缺血再灌注后NF-κB的影响及其保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物:Wistar大鼠75只，雌雄不拘，体重250 ～ 300g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。②主要试剂和仪器：6％水合氯醛（武汉同济医院药剂科），已酮可可碱注射液（由安徽环球药业股份有限公司提供），兔抗NF-κB P65亚单位多克隆抗体(美国Santa Cruze 公司)，链霉亲合素－生物素－酶复合物（SABC）检测试剂盒（武汉Boster公司）, IL-1βmRNA原位杂交检测试剂盒（武汉Boster公司）,原位检测凋亡细胞试剂盒（德国宝灵曼公司），DAB显色试剂盒（武汉Boster公司）。电热烧灼器（上海医疗器械八厂），光学显微镜（Olympus）,HPIAS-1000彩色病理图像分析系统（华中科技大学同济医学院实验医学中心）。

1.2 模型制作及标本采集 采用Pulsinelli等四血管阻塞的方法建立大鼠脑复苏模型。

以6%水合氯醛0.4ml/100g腹腔内注射（ip）麻醉。假手术组（A组）动物只分离第一颈椎两侧横突孔，但不电凝双侧椎动脉，分离双侧颈总动脉但不夹闭；全脑缺血再灌注组（B组）动物电凝双侧椎动脉并分别用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉10min，而后松开动脉夹形成再灌注；参附注射液治疗组（C组）于再灌注时给予参附注射液（5ml/kg）腹腔内注射，后每间隔6h予等量注射；全脑缺血再灌注组（B组）于再灌注时，给予等容量的生理盐水(5ml/kg)，后每间隔6h等量注射；实验中保持大鼠体温（37 ± 0.5）℃，未昏迷或缺血后有癫痫、抽搐等并发症大鼠均放弃。分别于再灌注2h, 6h, 12h, 24h和48h 5个时间点（每个时间点5只大鼠）迅速横断大鼠脊髓，取出脑组织，以4%多聚甲醛液固定后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，常规石蜡包埋，在脑海马CA1区连续切片，厚度6～8um。

1.3 观察项目及检测方法 ① NF-κB活性测定：用免疫组织化学染色检测；石蜡切片经新鲜配制的3％H2O2溶液灭活内源性过氧化物酶，0.1M PBS洗；加一抗（兔抗小鼠NF-κB P65 亚单位的多克隆抗体，经预定实验定为稀释度1:200），4℃置湿盒过夜，0.1M PBS洗；依次加入二抗（生物素化羊抗兔）和三抗（辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素），DAB显色。阳性细胞为光镜下细胞核内出现棕黄色物质。

② TNF-α mRNA的表达：用原位杂交法检测；石蜡切片经新鲜配制的3％H2O2溶液室温处理10分钟，蒸馏水洗；切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃消化10分钟，蒸馏水洗；每张切片上依次加入20μl的预杂交液和杂交液，置恒温箱杂交，（2～0.5）×SCC梯度处理，滴加封闭液和生物素化鼠抗地高辛，0.5M PBS洗5分钟×4次，再滴加SABC和生物素化过氧化物酶，0.5M PBS洗5分钟×4次，DAB显色。阳性细胞为光镜下胞浆中出现棕黄色物质。

③ 细胞凋亡：用原位末端标记法；切片常规脱蜡逐级酒精至水化；蛋白酶K（15μg/ml）,37°C，30min; PBS清洗后滴加原位末端标记法反应液（TDT buffer 8μl, 2mol/l Bio-dUTP 3μl, TDT酶0.4μl, 三水28.6μl）, 37°C,2h； 滴加SA复合物，37°C，1h；DAB显色5～20min(镜下监测，显色满意后终止反应)；苏木素复染，常规脱水、透明，中性树脂封片，镜下观察。显微镜微尺随机计数5个线性长度1mm的阳性细胞数，取平均值。

1.4 数据处理与统计学分析 光镜观察和定量分析运用HPIAS-1000彩色病理图像分析系统（同济医学院实验中心提供）对免疫组化和原位杂交的切片进行图像分析，分析过程中的所有切片的放大倍数、光源强度均相同。测定阳性细胞的平均光密度值（OD）。所得数据以（x[TX-]±s）表示，SPSS11.5软件处理，多组均数的比较用方差分析。NF-κB与TNF-α mRNA及细胞凋亡数的相关性，采用Pearson相关分析。P < 0.05表示差异有显著性意义。

2 结果

2.1 全脑缺血再灌注后NF-κB活性的变化 全脑缺血再灌注后海马CA1区NF-κB的活性于再灌注2h即明显升高（P

2.2 全脑缺血再灌注后TNF-α mRNA表达的变化 全脑缺血再灌后海马CA1区TNF-α mRNA的表达在再灌注2h即明显升高（P< 0.01），12h达到高峰，其后高峰逐渐下移，但在所观察的时间里，与假手术组比较差异均有显著性意义（P< 0.01）。在各对应时间点参附注射液可明显降低TNF-α mRNA的表达（P < 0.01）。见表2。

2.3 全脑缺血再灌注后细胞凋亡数的变化 全脑缺血再灌注后细胞凋亡数随再灌注时间的延长而逐渐增多(P < 0.01), 在各对应时间点参附注射液可明显减少再灌注后的细胞凋亡数（P < 0.01）。见表3。

3 讨论

炎症反应的激活是脑缺血再灌注损伤的重要机制。本研究以四血管阻塞的方法，复制出大鼠全脑缺血再灌注模型。大量研究表明，脑缺血再灌注可激活炎症反应，再灌注的炎症反应促进了继发性的脑损害，是脑再灌注损伤的主要原因之一。NF-κB作为一种普遍存在的转录因子，是多种信号转导途径的汇聚点，在调节脑缺血再灌注炎症反应的基因中起中心环节作用。脑缺血再灌注可导致NF-κB的激活在许多研究中都已得到证实。Berti R等［4］用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）的方法检测脑缺血再灌注后NF-κB的活性，发现在3h、6h、12h、24h和72h五个再灌注时间点NF-κB的活性均明显增高。Liu SJ等［5］用凝胶电泳迁移分析实验(EMSA)发现脑缺血再灌注0.5h后NF-κB的活性即明显升高，6h达到高峰，24h降到1h的水平。本实验发现，NF-κB的表达在2h即明显升高，6h达到高峰，后逐渐下降，但直至48h仍明显高于假手术组，与上述研究结果相符。激活后的NF-κB可高效诱导多种细胞因子、粘附分子和趋化因子等的表达，同时对参与炎症反应放大与延续（即级联瀑布效应）的多种酶的基因表达也具有重要的调控作用［6］。TNF-α是NF-κB介导产生的一种重要的细胞因子，它可通过多种途径造成组织和细胞损害：使白细胞浸润，血小板粘附内皮细胞，激活诱导型一氧化氮合酶（iNOS）通路产生过量一氧化氮（NO）等。Lavine等［7］用多克隆兔抗鼠中和抗体研究其对脑缺血再灌注损伤的作用，结果发现，抗TNF-α抗体可使局灶性脑损伤皮质梗死面积缩小71%，皮质下梗死面积缩小58%，并增加再灌注后脑血流量，特别是缺血中心区的脑血流量，促进神经功能恢复。本实验发现，全脑缺血再灌注时NF-κB活性与TNF-αmRNA表达均明显增加，细胞凋亡数也明显增加，说明NF-κB和TNF-αmRNA参与了细胞凋亡的发生，与Hickenbottom等［8］报道的相符。

因为，NF-κB是脑缺血再灌注后炎症反应的中心环节，所以拮抗NF-κB的活化，可能起到有效的抗炎效果，从而发挥脑保护作用。Carroll JE等［9］发现N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)，一种抗氧化剂既能明显地降低NF-κB的表达，也能有效减少脑梗死的面积。本组结果表明，参附注射液可减少全脑缺血再灌注时NF-κB在细胞核内的表达，并可在转录水平上抑制TNF-α mRNA的表达。结果说明，参附注射液在脑缺血再灌注治疗过程中可能通过抑制NF-κB的活化而抑制炎症介质如TNF-α的表达，从而对全脑缺血再灌注损伤起治疗作用。至于，参附注射液能否通过抑制NF-κB的活性进而抑制其它重要的炎症细胞因子如白介素－1β（IL－1β）、白介素-6（IL-6）和白介素-8（IL-8）等的表达，需进一步的实验证实。

本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。