斯普瑞达（SPRIDA）对SMMC-7721肝癌细胞生长和粘附功能的影响

作者：刘培勋，周则卫，徐文清，刘晓秋，刘正明，李松年

【摘要】 目的 使用SMMC-7721肝癌细胞株对SPRIDA-A、SPRIDA-B和SPRIDA-A+SPRIDA-B体外抑制肿瘤生长和粘附功能进行研究。方法 采用MTT比色分析法观察SPRIDA-A、SPRIDA-B、SPRIDA-A+SPRIDA-B对SMMC-7721肝癌细胞生长和粘附功能的影响，测定其生长抑制率和粘附抑制率。结果 SPRIDA-A对SMMC-7721肝癌细胞生长抑制作用不明显，SPRIDA-B和SPRIDA-A+SPRIDA-B对肝癌细胞生长有明显抑制作用，并呈剂量依赖关系；SPRIDA-B对SMMC-7721肝癌细胞粘附功能有明显抑制作用，并呈剂量依赖关系。SPRIDA-B作用于SMMC-7721肝癌细胞后，可见明显的凋亡细胞形态出现。结论 SPRIDA-B对SMMC-7721肝癌细胞生长和粘附功能有明显抑制作用，并可诱导细胞凋亡，是一个极具研究价值的抗肿瘤及抗转移的新药。

【关键词】 SPRIDA-A；SPRIDA-B；肝癌细胞；转移；粘附；凋亡

Effects of SPRIDA on growth and adhesion of hepatoma cell SMMC-7721

【Abstract】 Objective Study on SPRIDA-A，SPRIDA-B and SPRIDA-A+SPRIDA-B inhibit growth and adhesion of tumor in vitro by using hepatoma cell line SMMC-7721.Methods MTT was used to investigate the effect of SPRIDA-A，SPRIDA-B，SPRIDA-A+SPRIDA-B on growth and adhesion of hepatoma cell SMMC-7721，and detect the inhibition rate of growth and adhesion.Results SPRIDA-A could not obviously inhibit the growth of hepatoma cell SMMC-7721，SPRIDA-B and SPRIDA-A+SPRIDA-B could obviously inhibit the growth and adhesion of hepatoma cell SMMC-7721 in a dose dependent manner.It was clear that SPRIDA-B could induce the apoptosis of the cells，when it was used on hepatoma cell SMMC-7721.Conclusion SPRIDA-B that could obviously inhibit the growth and adhesion of hepatoma cell SMMC-7721 and induce the apoptosis of the cells，was an antitumor and antimetastasis drug with remarkable value for study.

【Key words】 SPRIDA-A；SPRIDA-B；hepatoma cell；metastasis；adhesion；apoptosis

苦豆子Sophor alopecuroides L为豆科槐属植物，在我国西北地区分布广泛。我们从其全草中提取、分离得到生物碱I，并经半合成、纯化制备得SPRIDA-A和SPRIDA-B，SPRIDA-A和SPRIDA-B为同分异构体。SPRIDA-A为人工构型，SPRIDA-B为天然构型。两者由于构型不同，生物活性也可能不同，为了验证其体外抗肿瘤和抗肿瘤转移作用，我们利用SMMC-7721肝癌细胞进行了其体外抗肿瘤及抗转移作用的研究［1～3］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 SPRIDA-A、SPRIDA-B，均为白色固体粉末，引吸湿性强，溶于水，纯度大于95%，由本实验室自制。

1.1.2 主要试剂 RPMI—60培养基、小牛血清、胰蛋白酶、MTT、二甲基亚砜（DMSO）购于中国医学科学院血液学研究所， ECMGEL购自sigma公司。

1.1.3 细胞系 SMMC-7721肝癌细胞株，购于中国医学科学院基础医学研究所。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SMMC-7721肝癌细胞常规培养于10%小牛血清、100U/ml青霉素及100U/ml链霉素的RPMI—60培养基中，置于37℃ CO2培养箱内培养，2～3d传代1次，以维持细胞处于对数成长期。

1.2.2 SPRIDA-A、SPRIDA-B、SPRIDA-A+SPRIDA-B对SMMC-7721肝癌细胞生长的影响 采用噻唑氮蓝（MTT）比色分析法。将对数生长期细胞接种于96孔培养板，细胞浓度为8×104/ml，每孔0.2ml，将SPRIDA-A、SPRIDA-B、SPRIDA-A+SPRIDA-B与细胞共培养24h，加150μl DMSO，全自动酶标仪测定波长490nm光密度（A）值，每孔设6个复孔。试验重复三次，计算各组均值。试验组按下式计算细胞生长抑制率：

生长抑制率（%）=（1-试验组A值/对照组A）×100%

1.2.3 SPRIDA-A、SPRIDA-B对SMMC-7721肝癌细胞粘附功能的影响 采用噻唑氮蓝（MTT）比色分析法。96孔板每孔中分别铺上ECM CEL各50μl，4℃过夜。加入1%BSA150μl/孔，37℃孵箱内孵育2h，倒置沥干。9002与细胞共培养24h，调节细胞浓度为8×104/ml，每孔加0.2ml，吸附1h，用无血清培养液洗2次，加入200μl完全培养液，加MTT 20μl/孔，37℃孵箱内孵育4h，加DMSO150μl/孔。全自动酶标仪测定波长490nm的光密度（A）值，每孔设4个复孔，试验重复二次，计算粘附抑制率：

粘附抑制率（%）=（1-加药组A值/未加药组A值）×100%

1.2.4 SPRIDA-A、SPRIDA-B对SMMC-7721肝癌细胞形态的影响 将对数生长期细胞接种于预先置有盖玻片的6孔培养板内，细胞浓度为8×104/ml，每孔2ml，SPRIDA-A、SPRIDA-B终浓度分别为3.7879×10-4mol/L、1.1364×10-3mol/L、2.2727×10-3mol/L与细胞共培养24h，取出盖玻片，Ciemsa染色后光镜下进行细胞形态学观察［4，5］。

2 试验结果

2.1 SPRIDA-A、SPRIDA-B单用SMMC-7721肝癌细胞的生长抑制作用 见表1。

表1 SPRIDA-A、SPRIDA-B单用SMMC-7721肝癌细胞的生长抑制作用

由表1可见，SPRIDA-B对SMMC-7221肝癌细胞生长的抑制作用大于SPRIDA-A。随着SPRIDA-B药物浓度增大，抑制率也明显增加，并呈剂量依赖关系。当药物浓度为1.1364×10-3mol/L时，抑制率可达60%。两组比较，差异有显著性（P<0.05）。

2.2 SPRIDA-B、SPRIDA-A+SPRIDA-B对SMMC-7221肝癌细胞的生长抑制作用 见表2。

表2 SPRIDA-B、SPRIDA-A+SPRIDA-B对SMMC-7221 肝癌细胞的生长抑制作用

由表2可见，SPRIDA-B，SPRIDA-A+SPRIDA-B对SMMC-7221肝癌细胞的生长均有抑制作用，并呈剂量依赖关系，但在同一剂量条件下相比，SPRIDA-A+SPRIDA-B对 SMMC-7221肝癌细胞的生长抑制作用更加明显，但两组比较，P＞0.05，差异无显著性。

2.3 SPRIDA-A，SPRIDA-B， SPRIDA-A+SPRIDA-B对SMMC-7221肝癌细胞的生长抑制作用 见表3。

表3 SPRIDA-A，SPRIDA-B，SPRIDA-A+SPRIDA-B对SMMC-7221肝癌细胞的生长抑制作用

由表3可见，SPRIDA-A对SMMC-7221肝癌细胞生长抑制作用不明显，而SPRIDA+SPRIDA-B和SPRIDA-B对SMMC-7221肝癌细胞生长均有明显的抑制作用，并呈剂量依赖关系。当药物浓度为1.1364×10-3mol/L时，抑制率SPRIDA-B为54%，SPRIDA+SPRIDA-B为64%。但组间比较，差异无显著性（P＞0.05）。

2.4 SPRIDA-A、SPRIDA-B对SMMC-7221肝癌细胞粘附功能的影响 见表4。

粘附能力是癌细胞侵蚀的始动步骤，高侵袭的肿瘤细胞与基底膜成分的异质性粘附能力通常增高，而肿瘤细胞间的同质性粘附能力则会下降。粘附试验表明，20min即可见SPRIDA-A组成部分细胞贴壁粘附，而SPRIDA-B组细胞仍处于圆形的悬浮状态。在本试验剂量范围内，SPRIDA-A对肝癌细胞的粘附功能没有明显影响。SPRIDA-B对肝癌细胞的粘附功能有明显抑制作用，并呈剂量依赖关系。当SPRIDA-B药物浓度为3.7879×10-4mol/L、1.1364×10-3mol/L、2.2727×10-3mol/L时，粘附抑制率分别为68%、90%、77%，与SPRIDA-A相比差异有显著性（P<0?05）。

2.5 SPRIDA-B、环磷酰胺对SMMC-7221肝癌细胞的生长抑制作用 见表5。

表4 SPRIDA-A、SPRIDA-B对SMMC-7221 肝癌细胞粘附功能的影响

表5 SPRIDA-B、环磷酰胺对SMMC-7221肝癌细胞的生长抑制作用

在本试验剂量范围内，环磷酰胺对SMMC-7221肝癌细胞的增值作用不明显。而SPRIDA-B对SMMC-7221肝癌细胞有明显抑制作用，并呈剂量依赖关系。当SPRIDA-B药物浓度为4.3030×10-3mol/L时，抑制率可达67%。但两组相比，P＞0.05，差异无显著性。

2.6 SMMC-7221肝癌细胞的形态学观察 观察不同浓度的SPRIDA-A、SPRIDA-B作用于SMMC-7221细胞24h后发现，SPRIDA-A组细胞形态大而有规则，核质比大，染色质深而致密，并且视野中细胞数目很多，而SPRIDA-B组细胞稀疏，数目少，形态不规则，有的呈梭形，有的呈圆形，核质比大，染色质较疏松。当SPRIDA-B浓度为1.1364×10-3mol/L时，可见有明显的凋亡细胞形态出现；细胞体积明显变小，薄膜皱缩，胞核固缩，染色质浓染，有的细胞表现为核碎裂，个别细胞部分胞浆崩解为碎片状，可见由膜裹内容物的所谓凋亡小体形成。

3 结论

试验结果表明：(1)SPRIDA-A单用对SMMC-7221肝癌细胞的生长抑制作用不明显。(2)SPRIDA-B单用对SMMC-7221肝癌细胞的生长抑制有明显作用，随着SPRIDA-B药物浓度增大，抑制率也明显增加，并呈剂量依赖关系，与SPRIDA-A相比，两组间相比，P<0.05，差异具有显著性。(3)SPRIDA-A+SPRIDA-B对SMMC-7221肝癌细胞生长有明显的抑制作用，并呈剂量依赖关系。与SPRIDA-B单用相比，P＞0.05，两组间差异无显著性。(4)粘附试验表明，SPRIDA-A对肝癌细胞的粘附功能没有明显影响，SPRIDA-B对肝癌细胞的粘附功能有明显抑制作用，并呈剂量依赖关系。与SPRIDA-A相比差异有显著性（P<0.05）。(5)在试验剂量范围内，环磷酰胺对SMMC-7221的抑制作用不明显，而SPRIDA-B对SMMC-7221肝癌细胞有明显抑制作用，并呈剂量依赖关系。但两组相比，P＞0.05，差异无显著性。(6)不同浓度的SPRIDA-A作用于SMMC-7221肝癌细胞后，细胞形态大而规则，核质比小，染色质深而致密，并且视野中细胞数目很多。而SPRIDA-B组细胞稀疏，数目少，形态不规则，核质比大，染色质较疏松。当SPRIDA-B浓度为1.1364×10-3mol/L时，可见明显的凋亡细胞形态出现。

4 讨论

SPRIDA-A与SPRIDA-B由于立体结构不同，可能表现为不同的生物活性，试验结果证实了这一点。可能与底物与受体作用有关。因为从结构上讲，SPRIDA-A具刚性，而SPRIDA-B具柔性，SPRIDA-B易与受体作用。所以SPRIDA-B活性更强。

SPRIDA-B不仅对SMMC-7221肝癌细胞生长有明显的抑制作用，而且对其粘附功能也有明显抑制作用，并可诱导细胞凋亡，从而影响肿瘤细胞的侵袭和转移，SPRIDA-B是一个很有开发价值的抗肿瘤及抗转移药物，值得深入研究。

【参考文献】

1 卫生部《新药（西药）临床前研究指导原则汇编（药学、药理学、毒理学）》.1993，137.

2 周则卫，刘培勋，徐文清，等.苦豆子生物碱衍生物9002急性毒性及体内抑癌活性的实验研究.海峡药学，2003，15（4）：14-16.

3 高虎，陈嘉屿，余西林.药物诱导细胞凋亡治疗肝癌.世界华人消化杂志，2001，9（6）：686-688.

4 鲁翠涛，梅兴国，龚伟，等.红豆杉细胞提取物对肿瘤细胞SMMC-7721和HEp-2的作用研究.中国药理学通报，2003，19（7）：801-803.

5 丁志山，高承贤，陈铌铍，等.姜黄素具有抑制血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡双重作用.中国药理学通报，2003，19（2）：171-173.