CD146在人骨肉瘤患者组织中的表达及其临床意义

摘要：目的 探讨CD146在骨肉瘤患者组织中的表达情况，并分析其与骨肉瘤临床特征的关系。方法 采用免疫组化法检测50例骨肉瘤患者组织中CD146的表达情况，并检测用CD34标记的肿瘤微血管密度MVD，并利用RT-qPCR和western blot方法检测骨肉瘤组织标本中CD146的表达。结果 CD146在骨肉瘤组织中过高表达，其MVD值显著高于骨肉瘤周围非恶性组织， CD146的表达与骨肉瘤的Enneking 分期及有无肺转移显著相关（P

关键词：CD146；骨肉瘤；表达

Abstract：Objective To investigate the expression of CD146 in osteosarcoma tissues and the relationship with clinical and pathological characteristics. Methods The expression of CD146 and microvessel density （MVD） in 50 cases of osteosarcoma tissues was determined by Immunohistochemistry， and further detecting the expression of CD146 in osteosarcoma tissues by RT-qPCR and Western blot. Results CD146 was overexpressed in Human Osteosarcoma Tissues， and the MVD value was significantly higher than nonmalignant tissue surrounding in osteosarcoma， and the expression level of CD146 was correlated with Enncking stage and pulmonary metastasis（P

Key words：CD146； Osteosarcoma； Expression

骨肉瘤是人类骨骼系统的恶性肿瘤中，发病率居首位，并且在青少年中也最为常见，其中在小儿骨恶性肿瘤发病率中约占5%，严重威胁了人类的健康。早期骨瘤肉患者（Enneking IIA期）一般临床症状轻微，难以察觉，由于骨肉瘤发展迅速，所以多数骨肉瘤患者（约75%）在初诊时已是中晚期（Enneking IIB/III期）。如今，由于新型的辅助化疗结合外科治疗的方法应用于骨肉瘤的治疗取得了突破性进展，使得骨肉瘤患者 5 年内生存率提高至60%左右[1]，但是仍有约50%的骨肉瘤患者会发生肺转移，一旦出现肺转移，5年生存率仅10%～15% [2]。

肿瘤血管生成（tumor angiogenesis，TA）及其在肿瘤发生、发展过程的重要作用为骨肉瘤发生和侵袭转移的机制研究提供了新的方向。恶性黑色素瘤细胞黏附分子（melanoma cell adhesion molecule， CD146）是肿瘤的血管生成过程重要的相关因子，它通过参与细胞间和细胞-细胞外基质之间的黏附作用促进肿瘤组织的血管生成，并且与多种肿瘤的扩散和转移息息相关 [3-5]。研究表明CD146在人体多种恶性肿瘤如人类恶性黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌等中表达明显增高[6]。但 CD146 在骨肉瘤发生发展中作用的基础研究还很薄弱，本研究采用免疫组织化学方法检测50 例人骨肉瘤组织中 CD146的表达，以 CD34 作标记，同时计数肿瘤组织的微血管密度（microvessel density，MVD），并结合RT-qPCR和western blot方法检测骨肉瘤组织标本中CD146的表达，探讨它与骨肉瘤临床特征的关系及其临床意义，为骨肉瘤的治疗研究提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 标本来源于武汉某三甲医院住院骨科患者，患者均签署知情同意且在未接受治疗前收集标本，包括30（60%）例男性和20（40%）例女性的恶性骨肉瘤组织、周围恶性骨肉瘤组织及周围非恶性组织，50例骨肉瘤患者的平均年龄为20岁（范围从7～31），病理证实所有标本均为骨肉瘤。

1.2试剂及仪器 CD146：上游引物5'-GAAAAAGTGTGGCTGGAAGT-3'，下游引物5'-GTTGTCGTTGGTTGTCTC TT-3'；内参基因：核糖体蛋白S18：上游引物5'-CGA TGG GCGGCG GAA AAT A-3'，下游引物5'-CTGCTTTCCTCAACACCACA-3'； QPCR反应仪为ABI 7500（ABI 公司）；日本Olympus BX51 光学显微镜；Real Time反应试剂盒（OMEGA公司）；逆转录试剂盒（Sigma公司）；总蛋白提取试剂盒（BestBio公司）。鼠抗人CD146单克隆抗体（美国Santa Cruz 公司产品）。CD34 鼠抗人单克隆抗体、抗鼠即用型快速免疫组化MaxVisionTM 检测试剂盒及DAB 染色试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）。

1.3实验方法

1.3.1 CD146及CD34 的免疫组化检测 将骨肉瘤及骨肉瘤周围非恶性组织标本制成4μm切片，参照试剂盒说明书进行免疫组织化学染色。简要过程如下：切片用二甲苯脱蜡后浸泡，高压抗原修复，血清封闭加一抗，4℃孵育过夜，再复温后加入二抗，孵育。用DAB 显色，苏木精对比染色后脱水、透明、封片。在光镜下观察结果。

1.3.2 免疫组化结果判定 CD146 以胞质及胞膜中出现棕黄色染色颗粒为阳性。微血管密度（microvessel density MVD）计数标准参照Weidner等校正并修改方法。采用 CD34 免疫组化染色标记血管内皮细胞，以胞质及胞膜中出现棕黄色染色颗粒为阳性。单个内皮细胞或细胞团，不管有没有形成管腔，只要被抗体染色并与周围的微血管、肿瘤细胞和其他连接组织分离，都认为是1个微血管，有平滑肌壁及管腔直径约大于8个红细胞直径的血管排除在外。先用低倍镜（×100）下在每一个标本中选择3个微血管数最多的区域，在每一个区域中计数1个高倍镜（×400）下的微血管数，取其均值为MVD值。

1.3.3 肉瘤组织中CD146的表达及western blot分析 提取组织样本中总RNA，反转录得cDNA，以此为模板Real time PCR检测，引物序列CD146：上游引物5'-GAAAAAGTGTGGCTGGAAGT-3'，下游引物5'-GTTGTCGTTGGTTGTCTC TT-3'；核糖体蛋白S18（RPS18）：上游引物5'-CGATGG GCGGCGGAAAAT A-3'，下游引物5'-CTGCTTTCCTCA ACACCAC A-3'。用ABI7500荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR实验。扩增的反应程序：94℃ 5min，94℃ 40s，50℃ 40 s，72℃ 50s，40循环。实验结果采用Ct法进行分析。提取样品总蛋白，确定蛋白样品的浓度后，加入等量样品到每个加样孔，进行WB检测，经曝光、显影及定影后，统计目的条带灰度值。

1.4 统计学分析 应用SPSS 16.0软件完成统计学处理。计量资料结果采用均数±标准差（x±s ）进行统计描述。计量资料采用t检验，计数资料采用分析。以P

2 结果

2.1 CD146和CD34在骨肉瘤组织中表达 免疫组织化学染色结果显示 CD146在骨肉瘤组织中多数呈阳性表达，在 50例骨肉瘤组织切片中，CD146 表达阳性 36 例，阴性 14 例，阳性率 72%。光学显微镜观察发现 CD146 主要表达于骨肉瘤组织的血管内皮细胞，当胞膜或胞浆中呈现棕黄色颗粒即为阳性（Fig.1），否则判定为阴性；CD34 标记的血管内皮细胞，以胞质内出现棕黄色颗粒为阳性判断标准（Fig.2），否则为阴性。染色结果显示所有骨肉瘤切片中 CD34 均呈阳性表达，根据 Weidner 的计数方法，骨肉瘤组中的MVD平均值为48.68±4.00 ，周围非恶性组织的MVD平均值为10.27±3.00，两者差异显著，具有统计学意义，P

2.2 肉瘤组织中CD146 mRNA的表达情况 由表2可见，随着临床分期的增加以及组织分化的进展，CD146的表达明显增加：其在III的表达量高于II、I期（P

2.3 肉瘤组织中CD146的western blot检测 周围非恶性组织组中CD146的表达水平均低于I，II和III组，相比差异显著，P

图3 骨肉瘤患者肉瘤组织中CD146的western blot检测

3 讨论

骨肉瘤已经成为严重危害青少年生命健康的 “杀手”之一，寻找更为有效的方法治疗骨肉瘤已经迫在眉睫。肿瘤血管生成及其在肿瘤发生，侵袭和转移过程的重要作用为骨肉瘤机制的基础研究提供了新的方向和思路。众所周知，肿瘤的生长需要通过血管供给氧及营养，并且恶性肿瘤细胞可进入其周围的肿瘤血管，并通过这种途径向周围转移扩散。因此，可以说肿瘤的发生发展的每一步，包括生长、浸润、转移和扩散都与TA这一关键步骤相关[6-8]。肿瘤处于无血管期时，主要通过周围组织的弥散作用来获取营养物质并清除代谢产物，当肿瘤增殖至一定的阶段将启动血管生成，进入血管期；但是由于新生的血管结构并不完整，相比成熟的正常血管，新生的血管更容易被肿瘤细胞沿新生血管开启的胶原裂隙侵袭，从而遭到破坏。肿瘤组织中的新生血管越多，预示着肿瘤体增长的速度越快，转移的可能性就越大，从而患者生存期就越短[9]。

CD146作为分子靶向或基因治疗的靶向位点研究成为国内外学者研究的热点。CD146 是属于黏附分子（cell adhesion molecule，CAM）家族的一种膜糖蛋白[10]。CD146通过与其他成分如肿瘤细胞、血管内皮细胞、细胞外基质等发生作用，参与重组细胞骨架、维持细胞形态、诱导局部细胞聚集、促使细胞游走和调控癌细胞无限增殖等过程。Kang等[11]研究数据表明，在血管新生过程中，CD146起到了重要作用，其中包括了新生血管生成的多个环节，如促使内皮细胞增殖、黏附和迁移。CD146 调节肿瘤血管形成的机制可能是激活了MMP-2，后者能够降解基膜和细胞外基质；激活生长因子，最主要是血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF），这种作用有利于肿瘤转移和肿瘤血管形成[13]。

本研究采用免疫组织化学方法结合RT-qPCR和western blot方法检测人骨肉瘤组织中 CD146的表达，探讨它与骨肉瘤临床特征的关系及其临床意义。研究结果显示，CD146在骨肉瘤组织中高表达，其MVD值显著高于骨肉瘤周围非恶性组织，并且利用RT-qPCR和western blot方法检测骨肉瘤组织标本中CD146的表达也同样证实了这个结论。同时，CD146的表达与骨肉瘤的Enneking 分期及有无肺转移显著相关（P

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