有关牛乳中大肠杆菌检验的分析

【中图分类号】R155 【文献标识码】A 【文章编号】1672－3783(2011)07－0270－01

【摘要】用大肠杆菌人工污染乳样品直接或8h增菌后提取DNA模板，以大肠杆菌丙氨酸消旋酶基因alr保守区设计引物，经过PCR扩增凝胶电泳检测，不增菌条件下全脂乳和脱脂乳的检出限为104CFU/ml，增菌后检出限为1CFU/ml。与国标鉴别培养法比较，PCR法时间缩短、灵敏度和准确度提高，该法更适宜乳品生产经营的快速实时检测。

【关键词】大肠埃希氏菌(大肠杆菌)；聚合酶链式反应(PCR)

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器 :非致病性大肠杆菌ATCC 25922菌株中国医学科学院菌种保藏中心；肠出血性大肠杆菌EHEC O157:H7 EDL933菌株中国疾病预防控制中心；金黄色葡萄球菌、乳酸链球菌、枯草芽胞杆菌和四联球菌陕西科技大学生物化学实验室；全脂乳和脱脂乳样品市购。麦糠凯培养基(MacConKey broth)由国产分析纯试剂配制；日本产伊红美蓝琼脂培养基(eosin methyleneblue，EMB)；乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管、革兰氏染色液均按GB/T 4789.28―2003中4.7规定制作。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化及牛乳样品制备:将大肠杆菌ATCC 25922和EHEC O157:H7 EDL 933菌种经二次斜面活化再液体培养，平板菌落计数后置于4℃冰箱保藏；按国标法检测证实无大肠杆菌的全脂乳和脱脂乳样品经巴氏灭菌，将活化大肠杆菌按不同接种量(106、105、104、103、102、101、100CFU/ml)制得人工污染样品。

1.2.2 基因组DNA模板提取:LB培养基中提取模板DNA采用水煮法，1ml菌液4500×g 15min离心弃上清液，重复水洗一次，沉淀用50μl无菌水混悬后煮沸6min，8000×g 5min离心取上清液5μl作为PCR扩增模板。

乳品中大肠杆菌模板DNA提取步骤如下：1ml人工污染样品中加入0.2ml无水乙醇、0.2ml氨水和0.2ml石油醚混匀后12000×g离心10min。沉淀用300μl 10mmo/LTE(pH7.8)溶解后，加入5μl 10mg/ml溶菌酶，37℃1h，期间不断剧烈振荡。然后加入50μl 10%的SDS煮沸5min。上述混合液中加入等体积的氯仿充分振荡混匀，13000×g离心10min收集上清液。上清液用0.1倍体积2.5mol/L乙酸铵(pH5.4)和2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA，13000×g离心20min，DNA沉淀干燥后用100μl灭菌超纯水溶解，4℃贮藏备用。

1.2.3PCR反应条件及其产物分析:PCR反应条件：25μl体系(2.5μl 10×PCR buffer、25.μl dNTPs、0.2μl 2.5U/μl Taq酶，引物alr1和引物alr2各2μl(4μmol/L)，5μl模板DNA)，94℃变性2min后进入PCR循环：94℃30s、66℃1min、72℃1min、25个循环、72℃充分延伸补足5min。PCR产物5μl采用电泳凝胶成像系统观察并分析。

1.2.4 PCR检测实验样品:引物特异性检验样品是将大肠杆菌ATCC 25922菌株、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、乳酸链球菌、枯草芽胞杆菌和四联球菌各1ml培养基(含菌量均为108CFU)，均采用1.2.2方法提取DNA模板。人工污染乳样品直接PCR扩增是将不同含菌量的乳样品采用1.2.2方法提取乳品模板DNA。增菌培养后PCR扩增是将1ml人工污染牛乳(含菌量分别为104、103、102、101、100、0.4CFU/ml)加入9mlMacConKey broth培养基37℃摇床振荡培养8h，4500×g 15min离心弃上清液，从沉淀中再采用1.2.2方法提取模板DNA。

2 结果与分析

2.1PCR引物特异性检验:应用实验设计的alr1和alr2引物对典型的非致病性大肠杆菌、强致病性大肠杆菌O157:H7和四种其他菌株进行PCR扩增。实验结果显示两株大肠杆菌均得到366bp大小的特异性扩增目标产物(阳性反应)，而其他四种菌株均未得到任何扩增条带(阴性反应)，并且多次实验的重复性良好，由此可得出在该实验条件下此引物建立的PCR检测方法对大肠杆菌具有特异性。

2.2 直接PCR扩增样品敏感性:检验从样品中提取模板直接PCR检测，阴性反应为泳道5和8，显示直接PCR扩增检测限为104CFU/ml，国家对其大肠杆菌检测限要求为90个/25ml。显然，这样的灵敏度不能达到国家对乳品卫生安全要求。所以，为了提高灵敏度，确保大肠杆菌的检测结果阳性，样品必须进行增菌培养。

2.3 增菌培养后PCR扩增样品的敏感性检测:对全脂乳和脱脂乳样品增菌培养后再提取模板DNA，进行PCR分析显示增菌后可以使PCR的检查下限变得更小，灵敏度提高，阴性对照无扩增带出现，阳性对照有366bp的扩增带出现，说明无假阴性或假阳性的结果出现，检测结果应视为有效，实验得出全脂乳和脱脂乳的大肠杆菌检测限均为100CFU/ml，达到国家乳品微生物检测限(90个/25ml)的要求。

2.4PCR与国标法的结果比较:应用PCR法和GB/T 4789.3―2003方法平行检测人工污染乳品中大肠杆菌，并对完成检测用时间、结果的灵敏度与准确性进行比较，结果显示PCR扩增法对样品检测所用时间最短(12h)，比MPN法快60h；在灵敏度及准确性方面，PCR扩增法的最低检测限为100CFU/ml，不含菌时检测结果阴性，国标法为小于3个且与不染菌乳样检测结果相同，可见PCR扩增法检测灵敏度高，结果更准确。

3 讨论

乳制品被普遍认为是致病性大肠杆菌的污染源，该类样品对PCR反应干扰因子主要为脂肪、金属离子、蛋白质等，所以如何有效消除干扰因子，制备出高纯度的模板成为实验的关键。本研究采用溶剂提取的方法来消除脂肪等因素的抑制作用，制备出高纯度的模板，实验证明建立的PCR检测乳品中大肠杆菌的方法可行，但是要达到实际应用还应对样品增菌的标准化及更多可能存在于乳品中的其他微生物对PCR反应特异性的影响进行深入评价研究。

参考文献

［1］ 欧盟第2005/2073/EC号规章.食品微生物学标准――乳及乳制品［S］.2005.

［2］ 徐尔尼,许杨,刘文群,等.快速检测大肠菌群数的研究［J］.南昌大学学报:理科版,2001,25(4):339-343.

作者单位：110031 大连市中山区疾病预防控制中心检验科