表没食子儿茶素没食子酸酯对阿霉素诱导心肌细胞凋亡的影响

摘要：目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）对大鼠阿霉素诱导心肌细胞凋亡的保护作用。方法 SD大鼠随机分为空白对照组、阿霉素组模型组和EGCG干预组。模型组采用阿霉素（15mg/kg）分6次隔日腹腔注射，EGCG组按1～5g/kg体重给予EGCG灌胃，空白对照组仅给予等体积生理盐水。采用缺口末端标记法检测心肌凋亡细胞，比色法检测Caspase-3的活性改变，Western blot检测bcl-2和bax蛋白的表达。结果 与模型组相比，EGCG能有效降低心肌凋亡和Caspase-3的活性。bcl-2和bax在正常心肌细胞中均有表达，阿霉素模型组bcl-2表达显著降低，bax表达上调，bcl-2/bax比率下降；金银子可明显增加bcl-2/bax比率。结论 EGCG能在一定程度上抑制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡，其机制可能与降低caspase-3活性，上调bcl-2/bax比率有关。

关键词：EGCG；阿霉素；心肌细胞；凋亡

表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是绿茶多酚提取物儿茶素的主要成分。研究发现它具有强大的抗氧化和清除自由基能力[1]。本实验以阿霉素建立心肌病动物模型，用不同浓度EGCG进行干预，观察其对阿霉素诱导大鼠心肌细胞凋亡的保护作用，并探讨其可能的作用机制，从而为心肌病治疗作出有益的探讨。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂

Annexin-V凋亡检测试剂盒购自美国BD公司，荧光染料H2DCFDA购自Molecular Probes公司。碘化丙锭购自Sigma-Aldrich。Caspase-3检测试剂盒购自南京凯基生物工程公司。兔抗鼠bcl-2，bax和β-actin多克隆抗体购自Santa Cruz。HRP标记羊抗兔IgG购自武汉博士德公司。ECL化学发光试剂盒为Pierce公司产品。EGCG购自Sigma。

1.2 心肌损伤大鼠动物模型的建立及EGCG干预

SD大鼠由南华大学实验动物部提供，体重（250±5）g，随机分为三组，正常对照组：常规饲料喂养，并给予等体积生理盐水灌胃；阿霉素模型组：采用阿霉素2.5mg/kg（用生理盐水稀释为0.5mg/ml）腹腔注射，隔日1次，共6次。EGCG干预组：分为低、中、高剂量组，即按每kg体重分别给予1g、3g、5g EGCG组灌胃。最后一次阿霉素处理各组存活的大鼠，24 h后，采用1%戊巴比妥钠0.3ml 腹腔注射麻醉大鼠，获取肺组织用于下一步检测。

1.3 采用缺口末端标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡

心脏标本后继续固定24h，常规石蜡包埋，切片脱蜡入水后蛋白酶K（20μg/ml）消化 15min； 1% H2O2甲醇溶液封闭内源性过氧化物酶，加入20μl TUNEL混合液，37℃孵育1h，TBS液漂洗、封闭；加入生物素标记抗地高辛抗体50μl 37℃孵育30min，TBS漂洗；DAB显色，苏木素复染。脱水、透明、封片后，镜下观察，随机观察5个200高倍视野，分别计数细胞核总数和凋亡细胞核数，计算凋亡指数（凋亡阳性细胞核数/总计数的细胞核×100%。

1.4 Caspase-3酶活性检测

心肌组织捣碎后加入50μl预冷的裂解缓冲液（含0.5μl DTT），冰上裂解20min，14000rpm离心3min后，获取上清用于检测Caspase-3的酶活性。反应体系中含50μl上清、2×反应缓冲液（含0.5μl DTT）和5μl Caspase-3底物，37℃避光孵育4h后用酶标仪（Tecan M200）测定405nm波长时的吸光度值。

1.5 Western blot检测bcl-2与bax表达

按上述方法获取心肌组织，用预冷PBS洗涤2次后加入组织裂解缓冲液制成匀浆，并冰上超声粉碎20min。4℃静置1h后，14000rpm离心30min，BCA法测定上清蛋白浓度。取约40μg蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜。室温封闭2h后根据不同实验目的加入抗bcl-2、bax及β-actin抗体于4℃孵育过夜。洗膜后加入HRP标记的二抗孵育1h，ECL发光、显影。

1.6 统计学分析

所有实验数据均平行测定3次，计量资料采用 ±S 表示，采用SPSS 13.0统计软件分析数据，P

2 结果

2.1 EGCG对心肌细胞凋亡率的影响

正常大鼠心肌细胞凋亡发生率很低。腹腔注射阿霉素后，心肌细胞凋亡明显增加，约为25.4%，不同浓度EGCG干预后，心肌细胞凋亡率随着EGCG浓度的增高而降低。当5g/kg EGCG处理后，凋亡率降至8.63%。

2.2 EGCG对心肌细胞Caspase-3表达的影响

如图2所示，阿霉素处理大鼠后，心肌组织中的Caspase-3水平明显高于正常对照组，而经1～5g/kg EGCG处理后，Caspase-3活性逐渐降低。经统计学分析，p

1.空白对照组；2.阿霉素组；3.阿霉素+EGCG低剂量组；

4.阿霉素+EGCG中剂量组；5.阿霉素+EGCG高剂量组

#P

2.3 EGCG对bcl-2和bax蛋白表达的影响

心肌细胞未刺激前bcl-2和bax呈一定水平表达。阿霉素处理后，bcl-2表达显著降低，bax表达增高。给予不同浓度EGCG后，bcl-2水平逐渐增高，bax含量逐渐降低，bcl-2/bax含量进一步增高。

3 讨论

阿霉素是一种高效广谱抗肿瘤药物，其特殊的化学结构使其极易在心脏异性蓄积，从而诱发药物性心肌病，导致扩张型心肌病和心力衰竭[2]。阿霉素导致心肌细胞凋亡是其心脏毒性的最终结局[3]。抗凋亡蛋白bcl-2主要分布于线粒体膜上，其功能主要是维持线粒体的正常功能、控制凋亡因子的外溢。bax以非活化状态存在于胞质中，在各种促凋亡因子的作用下，bax发生构象改变，移位于线粒体外膜，促进细胞色素C的释放而引起凋亡[4， 5]。本实验中，15mg/kg 的阿霉素处理大鼠后，bcl-2 基因表达明显下降，而bax基因表达明显增加，bcl-2/bax比值下降。而EGCG有明显的对抗阿霉素引起的促凋亡作用。即，EGCG通过下调促凋亡基因bax，上调bcl-2的表达从而增加bcl-2/bax的比值。除此之外，我们对各组大鼠Caspase-3的活性改变情况也进行了探讨，结果发现阿霉素作用后大鼠中Caspase-3均具有较高的活性。而当大鼠给予EGCG处理后，Caspase-3活性明显降低，通过上述机制起到抑制阿霉素所致心肌细胞凋亡的作用，从而减轻心肌损伤，改善心脏功能。最近研究发现NO可以通过抑制caspase-3的活性或抑制线粒体跨膜电势抑制凋亡，EGCG是否也在此环节发挥抗凋亡作用需进一步研究。

参考文献：

[1] Chen Y， Lee YD， Vedala H， et al. Exploring the chemical sensitivity of a carbon nanotube/green tea composite[J]. ACS Nano， 2010，4（11）：6854-6862.

[2] Tallaj JA， Franco V， Rayburn BK， et al. Response of doxorubicin-induced cardiomyopathy to the current management strategy of heart failure[J]. J Heart Lung Transplant， 2005，24（12）：2196-2201.

[3] Youn HJ， Kim HS， Jeon MH， et al. Induction of caspase-independent apoptosis in H9c2 cardiomyocytes by adriamycin treatment[J]. Mol Cell Biochem， 2005，270（1-2）：13-19.

[4] To H， Ohdo S， Shin M， et al. Dosing time dependency of doxorubicin-induced cardiotoxicity and bone marrow toxicity in rats[J]. J Pharm Pharmacol， 2003，55（6）：803-810.

[5] Chae HJ， Kim HR， Lee WG， et al. Radiation protects adriamycin-induced apoptosis[J]. Immunopharmacol Immunotoxicol， 2005，27（2）：211-232.