黄蜀葵花中黄酮类成分对前脂肪细胞增殖、分化及胰岛素抵抗的影响

[摘要] S蜀葵花中富含黄酮类成分，具有保护心血管、改善肾功能等作用。该文采用3T3-L1前脂肪细胞诱导分化的成熟脂肪细胞，建立胰岛素抵抗模型，分为正常组，模型组，异槲皮苷（HY）、金丝桃苷（JY）、槲皮素（QT）、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷（QG）、棉皮素-8-O-β-葡萄糖醛酸（GG）给药组，BCA法检测细胞培养液中葡萄糖的含量，荧光定量qPCR检测PPARγ，C/EBPα，SREBP-1，脂联素，内酯素，抵抗素基因mRNA的表达水平。结果显示，5种黄酮类化合物5 μmol・L-1浓度时可促进3T3-L1前脂肪细胞的增殖，浓度为100 μmol・L-1时可抑制前脂肪细胞的增殖；与正常组比较，模型组细胞对葡萄糖摄取量降低（P

[关键词] 锦葵科；黄属葵花；胰岛素抵抗；黄酮类成分；3T3-L1脂肪细胞

[Abstract] Abelmoschus manihot was rich in flavonoids，which has been reported the activity on protecting angiocarpy and improving renal function. This study aimed to explore the action mechanism of five flavonoids from A. manihot on how to ameliorating insulin resistance through the regulation of the glucose and expression of PPARγ，C/EBPα，SREBP-1，resistin，visfatin，adiponectin in 3T3-L1 adipocytes. After the 3T3-L1 preadipocytes were differentiated into mature adipocytes，insulin resistance model was built. Insulin resistance adipocytes were treated with 5，100 μmol・L-1 quercetin，isoquercitrin，hyperoside，quercitrin-3′-O-glucoside，gossypetin-8-O-β-glucoside. The glucose was indirectly determined by BCA kit. The mRNA expression levels of PPARγ，C/EBPα，SREBP-1，resistin，visfatin，adiponectin were detected by real-time quantitative PCR. Results showed that five flavonoids at 5 μmol・L-1 could accelerate preadipocytes proliferation and inhibit that at 100 μmol・L-1 Compared with the normal group，glucose uptake reduced significantly in model group （P

[Key words] Malvaceae；Abelmoschus manihot；insulin resistance；flavonoids；3T3-L1 adipocyte

doi：10.4268/cjcmm20162424

黄蜀葵花为锦葵科Malvaceae秋葵属Abelmoschus黄蜀葵Abelmoschus manihot （L.） Medic.的干燥花冠，始载于《嘉佑本草》，先后收录于《本草纲目》与2010年版《中国药典》。其味甘、辛；性凉；归心、肾、膀胱经；具有利尿通淋、活血、止血、消肿解毒的功效，主淋证，吐血，衄血，崩漏，胎衣不下，痈肿疮毒，水火烫伤。药理研究表明，黄蜀葵花具有保护心脑缺血损伤、改善肾功能、抗炎、抗氧化、抗病毒等各种生物活性[1-5]。化学成分研究发现，黄蜀葵花中主要含有黄酮类、还原糖类、鞣酸类及长链烃类等成分，其中黄酮类成分质量分数约占6%[6]，为其主要活性物质，主要包括金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷[7-8]。据报道[9]，总黄酮能降低链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的血糖，显著促进3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的吸收。异槲皮苷能促进2型糖尿病模型小鼠胰岛素分泌，从而发挥降糖作用[10]。槲皮素可激活PPARγ受体，促进3T3-L1脂肪细胞摄取葡萄糖，降低胰岛素抵抗[11]。金丝桃苷可显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性，减缓肠道对葡萄糖的吸收，降低餐后血糖[12]。其他黄酮类成分降糖作用研究较少，且相关作用机制尚未完全阐明。

本课题组前期通过对黄蜀葵花中黄酮类成分分析和分离纯化，获得异槲皮苷（HY）、金丝桃苷（JY）、槲皮素（QT）、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷（QG）、棉皮素-8-O-β-葡萄糖醛酸（GG）。本文采用高糖诱导3T3-L1脂肪细胞建立胰岛素抵抗模型，对其改善胰岛素抵抗作用进行研究，评价指标包括细胞增殖，细胞分化，细胞葡萄糖摄取率，PPARγ，脂联素（adiponectin），CEBPα，SREBP1，内酯素（visfatin），抵抗素（reststin）mRNA的表达水平，探讨以上5种黄酮类成分对胰岛素抵抗的改善作用，为该类资源性化学物质的开发利用提供科学依据。

1 材料

1.1 细胞株 3T3-L1细胞购买于南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 药物 异槲皮苷、金丝桃苷、槲皮素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、槲皮素-8-O-β-葡萄糖醛酸均为实验室自制，纯度均高于95%。

1.3 试剂 FBS（美国 ExCell Biology公司，批号FBS500）；PBS（中国南京凯基生物科技发展有限公司，批号KGB500）；胰蛋白酶-EDTA 消化液（南京凯基生物科技发展有限公司，批号KGY001）；DMEM （美国 GIBCO，批号12800-082）；96-well Cell Culture Plate （Corning Incorporated，批号3599）；Calf Serum（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号090817）；RPMI1640（GIBCO，批号31800-105）；MTT（BIOSHARP，批号201108）；DMSO （SIGMA，批号D2650）；Fetal Bovine Serum （ExCell Biology，批号FSP500）；DMEM（美国GIBCO公司，批号12800-082）；cDNA 第一链合成试剂盒（Fermentas，Lithuania， K1622）；Realltime PCR Master，Mix （SYBR Green） （TOYOBO，日本，批号QPK201）；TRIzol （Invitrogen，美国，批号15596-026）；agarose（Biowest，西班牙，批号111860）；50×TAE电泳缓冲液 （KeyGen，中国，批号KGM020）；氯仿，异丙醇（南京化试，500 mL）；0.1% DEPC Water （KeyGen，批号KGDN4500）；细胞裂解液 （Cell signaling technolgy，批号9804）；蛋白快速定量试剂盒（日本，伯乐生命医学产品有限公司）。

1.4 仪器 超净工作台（苏州净化，SW-CJ-1FD）；CO2培养箱（SANYO，XD-101）；生物倒置显微镜（OLYMPUS，IX51）；酶标仪（BioTek Instruments，EL-x800）；细胞培养瓶（TissueCulture Flask）（FALCON，353014）；分光光度计（SHIMADZ，UV-2540）；高速冷冻离心机（美国科俊仪器公司，SH03014）；低温冰箱（Sanyo，日本，1500）；电子天平（Sartorias，BL310）；组织匀浆器（海门市爱苯德，2 mL）；立式压力锅（上海博讯，YXQ-LS-50）；恒温水浴箱（常州国华电器有限公司，HH-4）；电热恒温干燥箱（上海润东荣丰科学仪器有限公司，101-AS-3）；压力蒸气灭菌器（上海博迅医疗设备厂，YXQ-LS-30S1）；pH（梅特勒-托丽多仪器公司，DELTA320）；振荡器（上海沪西分析仪器厂，WH-2）；PCR循环仪（Labnet，America，MultiGene Gradient）；荧光定量PCR循环仪（中山达安，DA7600）；核酸电泳仪（北京六一，DYY-6B）；凝胶成像仪（BIO-RAD，Gel Doc XR）；多用脱色摇床（江苏金坛市正基仪器厂，HY-4）。

2 方法

2.1 MTT法检测5种黄酮化合物对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响 3T3-L1 脂肪细胞经细胞消化、计数、配制成浓度为3×104～5×104个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100 μL细胞悬液（每孔3×103～5×103个细胞），置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h，同时设立阴性对照组 （称NG组）：3T3-L1 脂肪细胞，加10% FBS的DMEM高糖培养基；低、高浓度不同药物组：3T3-L1 脂肪细胞，分别加含5，100 μmol・L-1的IQT，HY，QT，QG，GG的10% FBS的DMEM高糖培养基。在培养箱中分别培养24，48，72 h后，每孔加入20 μL MTT（5 g・L-1），在培养箱继续培养4 h，弃去培养基，每孔加入150 μL DMSO溶解，摇床10 min轻轻地混匀，酶标仪490 nm下测定每孔吸光度（A）。实验组抑制率=（A阴性对照组-A实验组）/A阴性对照组×100%。

2.2 油红O染色检测5种黄酮化合物对 3T3-L1前脂肪细胞诱导分化的影响 37 ℃，5% CO2条件下，将3T3-L1前脂肪细胞置于含10% FBS的DMEM高糖培养基中培养，待细胞充分融合48 h后，设立空白组（实验过程中一直用含10% FBS的DMEM高糖培养基培养，简称control组）；对照组（简称NG组）与样品组加入含1 μmol・L-1地塞米松、0.5 mmol・L-1 IBMX、10 mg・L-1胰岛素、10% FBS的DMEM高糖培养基培养；培养2 d后，对照组换成10 mg・L-1胰岛素，10% FBS的DMEM高糖培养基培养2 d，接着用10% FBS的DMEM高糖培养基继续培养，每2 d换液1次，诱导分化8～12 d，样品组在加分化液的同时分别加入100 μmol・L-1的IQT，HY，QT，QG，GG，药物与培养液同步更换。分化第8天，对照组的3T3-L1前脂肪细胞90%左右呈现“戒环状”脂肪细胞表型，开始油红O染色，用异丙醇处理染色的细胞，570 nm波长检测A。

2.3 3T3-L1 脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立及分组 将分化成熟的脂肪细胞置于培养板中，用低葡萄糖DMEM培养基（其中含1% BSA，5.5 mmol・L-1葡萄糖）培养12 h后，设置空白组（简称NG组）：含5.5 mmol・L-1葡萄糖，1% BSA，1×10-9mol・L-1胰岛素的DMEM培养基；高糖模型组（简称HG组）：含25 mmol・L-1葡萄糖，1% BSA，1×10-6mol・L-1胰岛素的DMEM培养基；样品组：含25 mmol・L-1葡萄糖，1% BSA，1×10-6mol・L-1胰岛素的DMEM培养基，并分别添加100 μmol・L-1 IQT（简称IQT组）、HY（简称HY组）、QT（简称QT组）、QG（简称QG组）、GG（简称GG组）。37 ℃，5% CO2条件下培养2 d后弃培养液，用KRP缓冲液冲洗3次，再用KRP缓冲液（其中含1×10-9mol・L-1胰岛素）37 ℃孵育30 min；加入0.5 μCi・mL-1[3H]-葡萄糖，37 ℃孵育10 min，然后用预冷的PBS （其中含10 mmol・L-1葡萄糖）快速冲洗3次中止反应。然后，加入0.1 mol・L-1 NaOH 1 mL反应2 h，取细胞裂解液分析。用液闪仪计数检测蛋白裂解液的每分钟脉冲数（cpm），用BCA法测定蛋白裂解液的蛋白浓度，每个组都重复3次，葡萄糖摄取计算公式：葡萄糖摄取=cpm/（蛋白浓度×10.656）（单位nmol ・g-1・min-1）。

2.4 5种黄酮化合物干预前后脂肪细胞内PPARγ，C/EBPα，SREBP-1，脂联素，内酯素，抵抗素基因表达的变化 6孔板中模型组及100 μmol・L-1样品组的细胞相应处理后，每孔加入 1 mL Trizol，按试剂盒说明书提取各孔总RNA，根据 260 nm 与 280 nm的吸光度比值检测总 RNA 的纯度，A260/A280=1.8～2.1，经纯度检测合格后，进行 PCR反应，扩增产物PPARγ，脂联素，C/EBPα，SREBP1，内酯素，抵抗素，GADPH的片段进行琼脂糖核酸电泳，其中GADPH为内参。PPARγ的上游引物5′-GCCAGTTTCGATCCGTAGAA-3′，下游5′-AATCCTTGGCCCTCTGAGAT-3′，扩增长度187 bp；C/EBPα的上游引物5′-TTACAACAGGCCAGGTTTCC-3′，下游5′-GGCTGGCGACATACAGTACA-3′，扩增长度188 bp；SREBP-1上游引物5′-CCGTCACTTCCAGCTAGACC-3′，下游5′-GGTGCCTACAGAGCAAGAGG-3′，扩增长度173 bp；脂联素上游引物5′-GTTGCAAGCTCTCCTGTTCC-3′，下游5′-TCTCCAGGAGTGCCATCTCT-3′，扩增长度192 bp；内酯素上游引物5′-TACAGTGGCCACAAATTCCA-3′，下游5′- AATGAGCAGATGCCCCTATG-3′，扩增长度158 bp；抵抗素上游引物5′-AGGGTGTGTGTGGGAATTGT-3′，下游5′-CCAAGGTCCAGTCTCCTCTG-3′，扩增长度170 bp。重复3次实验。

2.5 统计学方法 所有数据均使用SPSS 16.0软件包进行统计学分析，计量资料用±s表示。组间比较采用单因素方差分析，P

3 结果

3.1 5种黄酮化合物对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响 MTT实验表明，100 μmol・L-1的QT，IQT，QG，GG，HY均能显著抑制前脂肪细胞增殖，在培养48 h后，各化合物的抑制率依次为53.58%，38.39%，46.20%，31.45%，44.03%；培B72 h后，各化合物的抑制率依次为62.81%，42.26%，55.14%，23.30%，42.26%（图1A）。当化合物浓度降至5 μmol・L-1时，反而能促进前脂肪细胞的增殖，培养48 h后其增值率依次为19.96%，20.61%，22.78%，23.21%，17.57%；培养72 h后其增值率依次为23.73%，19.39%，22.72%，25.90%，18.23%（图1B）。

3.2 5N黄酮化合物对3T3-L1 前脂肪细胞分化的影响 对照组在 DMEM 高糖培养基中的3T3-L1前脂肪细胞，镜下观察细胞可见其形态不规则，细胞有多个类似于成纤维细胞的伪足（图2）。按照上述诱导方法诱导8 d后，对照组及样品组3T3-L1 前脂肪细胞均呈现典型的脂肪细胞细胞表型。根据脂肪具有可被油红O染成红色的特性，经油红O染色后，90%的成熟脂肪细胞显微镜下胞浆中清晰可见红色较大脂肪滴，空白组无明显变化（图2） 。且从图2可以看出，100 μmol・L-1的IQT，HY，QT，QG，GG均能促进3T3-L1前脂肪细胞分化成成熟的脂肪细胞。

3.3 5种黄酮化合物对 3T3-L1 脂肪细胞葡萄糖摄取率的影响 对照基值（100%）为空白组（NG组）葡萄糖摄取量，各组分别与之相比作为各自葡萄糖摄取率。与空白组相比，模型组细胞对葡萄糖的摄取率降低了52%（P

3.4 5种黄酮化合物对脂肪细胞内PPARγ，C/EBPα，SREBP-1，脂联素，内脂素，抵抗素 mRNA表达的影响 采用 PCR技术，检测3T3-L1脂肪细胞与糖脂代谢及胰岛素抵抗相关基因PPARγ，C/EBPα，SREBP1，脂联素，内脂素，抵抗素mRNA的表达水平（图4）。与空白对照组相比，模型组细胞中PPARγ，C/EBPα及脂联素基因表达量明显下调，SREBP-1，内脂素，抵抗素基因表达量明显上调，且均具有统计学差异（P

4 讨论

胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要病理机制，一直以来作为糖尿病研究的热点问题[14-15]。

胰岛素敏感性的下降主要由肝糖输出功能增强，脂肪组织和肌肉组织摄取葡萄糖能力减弱导致[16]。因此调节糖脂代谢提高胰岛素敏感性的药物研究显得尤为重要。

前脂肪细胞的增殖和分化导致脂肪细胞的数量增加，在此结果下，脂肪细胞内脂滴的积聚则会引起脂肪细胞的肥大增生，体积增大，导致细胞膜上分布的胰岛素受体的数量相对减少，从而使组织细胞对胰岛素的敏感性下降，引起胰岛素抵抗，导致机体血

糖升高。本研究结果表明，异槲皮苷、金丝桃苷、槲皮素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、槲皮素-8-O-β-葡萄糖醛酸黄酮类成分在浓度为5 μmol・L-1时可促进3T3-L1前脂肪细胞的增殖，在浓度为100 μmol・L-1时可显著抑制其增殖，提示可通过控制各黄酮单体的浓度来调控前脂肪细胞的增殖，防止其过度增殖导致的脂肪细胞肥大增生。

分化成熟的脂肪细胞可以通过增加对葡萄糖的消耗来降低机体血糖水平。其分化可引起一些重要的转录因子表达的变化，如PPARγ，C/EBPα，SREBP-1等。PPAR属激素核受体超家族成员，由PPARα，PPARδ，PPARγ组成，其中PPARγ最具脂肪组织特异性，影响脂肪细胞中相关基因表达，是胰岛素细胞间信号传导的主要调节者，参与脂肪细胞分化、糖脂代谢和胰岛素抵抗等过程[17-19]。C/EBP家族有C/EBPα，β，γ等成员，其中C/EBPα是对脂肪细胞分化最具影响的因子，它对于促进PPARγ的高表达，维持分化细胞的表型起着关键性的作用[20]。SREBP-1主要在肝组织和脂肪细胞中表达，参与脂肪酸的调控、甘油三酯的合成以及糖代谢相关酶基因的表达，当其在脂肪组织中出现高表达时，使肝脏对胰岛素发挥作用蛋白的合成受到限制，从而使胰岛素敏感性下降，形成胰岛素抵抗。有研究显示，脂联素基因敲除小鼠与空白对照组相比出现明显的胰岛素抵抗[21]；抵抗素可抑制胰岛素信号转导通路，降低脂肪细胞对葡萄糖的摄取率[22-23]。

本研究结果表明，100 μmol・L-1异槲皮苷、金丝桃苷、槲皮素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、槲皮素-8-O-β-葡萄糖醛酸黄酮类成分，通过提高糖脂代谢及细胞分化相关因子PPARγ，C/EBPα，脂联素的表达，抑制SREBP-1，内脂素，抵抗素的表达，从而促进前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞，提高其对葡萄糖的摄取率，进而增加脂肪组织胰岛素敏感性。

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