1,3—二苯—1,3—丙二酮对二甲基亚硝胺致小鼠急性肝损伤的保护作用

北京大学公共卫生学院毒理学系国家中医药管理局中药配伍减毒重点研究室，北京 100191

[摘要] 目的 探讨1，3-二苯-1，3-丙二酮（DPPD）对二甲基亚硝胺（DMN）急性肝损伤的保护作用。 方法 小鼠按体重随机平均分为五组，分别为对照组、DMN组和三组剂量组。剂量组分别经口灌胃给予小鼠DPPD 100、200、400 mg/kg体重每日1次，连续4 d，然后腹腔注射给予致肝毒性剂量DMN（22 mg/kg体重）。染毒后24 h测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）活性；制备肝匀浆，改良Hission法测定肝中还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量，TBA法测定肝中丙二醛（MDA）含量；HE染色处理肝脏组织切片，光镜观察病理学改变。 结果 与单独给予DMN组相比，给予DPPD组明显改善了DMN引起体重降低的现象，DMN+DPPD高剂量组[（24.3±1.5）g]与DMN组[（22.7±1.0）g]相比，差异有统计学意义（P < 0.05）；并且显著降低血清中ALT、AST、LDH含量，DMN+DPPD高剂量组[ALT：（151±38）U/L，AST：（216±131）U/L，LDH：（1423±813）U/L]与DMN组相比[ALT：（1481±575） U/L，AST：（1155±559） U/L，LDH：（3196±784） U/L]，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。相比单独给予DMN组，给予DPPD组肝脏病理损伤明显改善，并呈一定的剂量效应关系。进一步研究表明，预防性给予DPPD各组可改善DMN引起的肝脂质过氧化现象，且相比单独给予DMN组，给予DPPD组的GSH/GSSG比值显著增加， DMN+DPPD高剂量组（10.734±0.572）与 DMN组（6.873±0.587）相比，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 DPPD可有效抵抗DMN对ICR小鼠肝脏造成的毒性损伤，调动机体抗氧化应激系统为可能的机制。

[关键词] 1，3-二苯-1，3-丙二酮；二甲基亚硝胺；急性肝损伤；小鼠；保肝作用

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）03（b）-0023-05

Protective effects of 1， 3- diphenyl-1， 3- propanedione on Dimethylnitrosamine-induced liver injury in mice

LIU Xin XUE Ru JIA Fenglan RUAN Ming ZHANG Baoxu

Key laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine， Department of Toxicology， School of Public Health， Peking University Health Science Center， Beijing 100191， China

[Abstract] Objective To examine the protective effects of 1， 3-diphenyl-1， 3-proanedione （DPPD） on Dimethylnitrosamine （DMN）-induced hepatotoxicity on ICR mice. Methods Mice were randomly divided into 5 groups as follows： control group， DMN group and three dosage groups. Three dosage groups administered in intragastrically with DPPD at doses of 100， 200 and 400 mg/kg body weight respectively for 4 d. 24 hours after DMN injection （22 mg/kg body weight）， the serum enzyme including alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， lactate dehydrogenase （LDH） were measured. The content of reduced glutathione （GSH） and oxidized glutathione （GSSG） were examined by Hisssion method， and the content of malondialdehyde （MDA） was examined by TBA method. Histopathological analysis were also made to observe the pathological chagne. Results Compared with DMN group， DPPD administration restored the body weight to normal， the difference between the DMN+DPPD highest dose group [（24.3±1.5） g] and DMN group [（22.7±1.0） g] was statistically significant （P < 0.05）； and significantly decreased the serum of ALT， AST and LDH， the differences between the DMN+DPPD highest dose group [ALT： （151±38） U/L， AST： （216±131） U/L， LDH： （1423±813） U/L] and DMN group [ALT： （1481±575） U/L， AST： （1155±559） U/L， LDH： （3196±784） U/L] were statistically significant （P < 0.01）. Liver histopathological examination showed that DPPD administration antagonized DMN-induced liver pathological damage in a dose-dependent manner. Further tests showed that DPPD significantly reduced the hepatic lipid peroxidation induced by DMN， and the ratio of GSH/GSSG was induced significantly by DPPD to antagonize DMN-induced hepatotoxicity， the difference between the DMN+DPPD highest dose group （10.734±0.572） and DMN group （6.873±0.587） was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion DPPD can effectively protect ICR male mice from DMN-induced hepatotoxicity. Reduction of oxidative stress may be part of the protection mechanism.

[Key words] 1， 3-diphenyl-1， 3-propanedione； Dimethylnitrosamine； Acute liver injury； Mice； Hepatoprotection

1，3-二苯-1，3-丙二酮（DPPD）是从甘草根中提取所得的一种β-二酮类物质。根据目前所得的研究结果，甘草根本身具有肝脏保护作用，并且已经在临床应用试验中获得了成功[1]。甘草根在大鼠体内试验中证明对四氯化碳造成的肝损伤有一定的保护作用[2]。本研究室现有研究已经证明，DPPD对二甲基亚酰胺、四氯化碳、可卡因和对乙酰氨基酚造成的急性肝损伤具有很好的预防作用[3-6]，且DPPD对四氯化碳所致肝损伤的预防作用优于甘草酸和甘草次酸[6]。在本研究中，主要针对DPPD对二甲基亚硝胺（DMN）造成的急性肝损伤的预防作用进行研究。

DMN是一种环境污染物和食物中的亚硝胺物质。在较高剂量时，DMN可引起肝脏毒性、肝癌，并可引起人和动物的机体突变反应。已有实验表明，DMN在大鼠体内可引起肝脏纤维化[7-10]。DMN引起的肝脏损伤具有特征性表现，如肝脏急性出血、肝细胞坏死和肝细胞核固缩。此外，在DMN引起的急性损伤的肝脏中，DNA降解的靶点被认为是核染色体[11-13]。给予小鼠单次注射DMN引起的肝脏急性损伤与DMN引起的人体肝脏急性损伤表现类似[11]，因此，DMN造成的肝损伤模型被广泛运用于研究中。

在本次实验中，通过DMN诱导建立的急性肝损伤模型，对DPPD的肝损伤保护作用进行检测，并对DPPD可能的肝保护机制进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

1，3-二苯-1，3-丙二酮（DPPD）购自Acros公司（New Jersey，USA），用时以1%（V/V）吐温-80（购自Amresco公司，Solon，USA）水溶液配制成混悬液；二甲基亚硝胺，购自Sigma-aldrichTM，INC（St. Louis，USA）用时用生理盐水配制；N-乙基顺丁烯二酰亚胺（NEMI），上海丽珠东风生物技术有限公司产品；十二烷基磺酸钠（SDS），Serva进口分装，上海化学试剂厂；硫代巴比妥酸（TBA）购自阿拉丁（上海）试剂有限公司；其余试剂无特殊说明均为分析纯。

1.2 动物及处理

ICR雄性小鼠20～22 g[购自北京大学医学实验动物中心，生产许可证号：SYXK（京）2006-0008]，实验前适应环境饲养3 d，实验期间所有动物自由饮食饮水，饲养环境温度控制在21～25℃，湿度60%～70%，12 h/12 h昼夜循环。

30只小鼠按体重随机平均分为五组：对照组，给予1%（V/V）吐温-80水溶液灌胃4 d，qd；DMN组，前3 d不进行任何处理，第4天腹腔注射给予DMN 22 mg/kg体重；DPPD不同剂量组，分别经口灌胃给予DPPD 100、200、400 mg/kg体重4 d，第4天经口给予DPPD 30 min后腹腔注射给予DMN 22 mg/kg体重。腹腔注射DMN 24 h后，小鼠眼底球后静脉丛取血。随后小鼠处死解剖取肝脏，称重，计算肝体比。留取肝脏样品用于进一步测定。

1.3 生化指标测定

血清酶学指标：丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）。小鼠眼底球后静脉丛取血后，经3000 r/min离心15 min后分离血清进行生化指标测定，测定使用HITACHI-7072自动生化分析仪。取部分肝大叶组织置于冰KCl溶液（0.15 mol/L）或者磷酸盐缓冲液制成5%（W/V）组织匀浆分别用于测定丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG），使用试剂盒进行测定，其中GSH和GSSG的含量使用改良Hission法测定，肝脏中MDA含量使用TBA法测定。随后根据测定结果计算GSH/GSSG的比值。

1.4 组织病理检查

切取肝左叶在10%福尔马林溶液中固定。常规病理切片，HE染色后，光学显微镜下观察肝组织病理改变。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DPPD对DMN所致肝损伤小鼠体重、肝重、肝体比的影响

与对照组比较，小鼠在给予DMN后体重明显降低，且差异有统计学意义（P < 0.05）；肝体比增加，但差异无统计学意义（P > 0.05）。给予DPPD的3个剂量组中小鼠与DMN组比较，体重有所升高，且在DMN+DPPD高剂量（400 mg/kg）组，差异有统计学意义（P < 0.05）；与DMN组比较，肝重、肝体比在DMN+DPPD中高剂量组均有所升高，与高剂量组差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

表1 1，3-二苯-1，3-丙二酮对二甲基亚硝胺所致小鼠体重

与肝重的影响（x±s）

注：与对照组比较，bP < 0.05；与DMN组比较，cP < 0.05，dP < 0.01；DMN：二甲基亚硝胺；DPPD：1，3-二苯-1，3-丙二酮

2.2 DPPD对DMN引起小鼠血清酶学指标改变的影响

与对照组比较，单次腹腔注射给予DMN（22 mg/kg体重）24 h后，血清ALT、AST和LDH水平升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与单独注射DMN组相比较，给予DPPD各组血清ALT、AST和LDH水平明显下降，在DMN+DPPD（200 mg/kg）中剂量和DMN+DPPD（400 mg/kg）高剂量组，差异有高度统计学意义（P < 0.01），且DPPD各组存在剂量反应关系。DMN+DPPD（100 mg/kg）低剂量组与DMN组比较，血清ALT、AST和LDH水平下降差异无统计学意义（P > 0.05）。DMN+DPPD（400 mg/kg）高剂量组血清AST和LDH水平与对照组相比，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

表 2 1，3-二苯-1，3-丙二酮对二甲基亚硝胺致肝损伤小鼠

血清ALT、AST、LDH水平的影响（U/L，x±s）

注：与对照组比较，bP < 0.01；与DMN组比较，dP < 0.01；DMN：二甲基亚硝胺；DPPD：1，3-二苯-1，3-丙二酮；ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶；LDH：乳酸脱氢酶

2.3 DPPD对DMN致肝损伤小鼠肝组织MDA和GSH/GSSG比值的影响

DMN组小鼠与对照组比较，肝组织中MDA含量明显升高，GSH/GSSH比值明显下降（P < 0.01）。而给予DPPD的各组与DMN组相比较，肝组织MDA水平明显下降同时GSH/GSSG比值明显升高，且在DMN+DPPD（200 mg/kg）中剂量组和DMN+DPPD（400 mg/kg）高剂量组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表3。

表3 1，3-二苯-1，3-丙二酮对二甲基亚硝胺致肝损伤小鼠

肝组织MDA含量和GSH/GSSG比值的影响（x±s）

注：与对照组比较，bP < 0.01；与DMN组比较，dP < 0.01；DMN：二甲基亚硝胺；DPPD：1，3-二苯-1，3-丙二酮；MDA：丙二醛；GSH/ GSSG：还原性谷胱甘肽/氧化性谷胱甘肽

2.4 DPPD对DMN造成的肝脏病理损伤的缓解作用

肉眼观察小鼠肝脏，对照组小鼠肝脏颜色为红褐色，有光泽，湿润，富有弹性。而单独给予DMN组肝脏则失去光泽，深红色，质脆，且在肝脏表面可见大量灰黄色点状坏死灶。给予DPPD各组与单独给予DMN组相比较，肝脏大体有明显的改善。

光镜下观察，对照组小鼠肝脏肝小叶轮廓清晰，细胞胞质丰富，核大而圆，核仁清晰（图1A）。而DMN组可见正常肝小叶结构被破坏，小叶间可见大量坏死，部分小叶轮廓已消失，肝细胞表现出坏死、淤血、核固缩或核溶解破碎，还可观察到肝细胞边缘的消失和肝细胞间的炎症细胞浸润（图1B）。预防性给予DPPD的各组肝脏损伤减轻，可见肝小叶结构和轮廓，小叶间坏死减少，且这种减轻程度具有一定剂量依赖关系。DMN+DPPD 100 mg/kg组（图1C）仍可见部分细胞坏死及小叶间坏死；DMN+DPPD 200mg/kg组（图1D）肝脏损伤减轻明显，而DMN+DPPD 400 mg/kg组（图1E）肝脏组织已接近正常对照组，肝小叶轮廓清晰。

A：对照组；B：DMN组；C：DMN+DPPD 100 mg/kg组 D：DMN+DPPD 200 mg/kg组 E：DMN+DPPD 400 mg/kg组

图 1 1，3-二苯-1，3-丙二酮对二甲基亚硝胺致肝损伤小鼠

肝组织病理的影响（HE染色，200×）

3 讨论

从研究结果中可见，腹腔注射给予小鼠22 mg/kg体重 DMN 24 h后，小鼠体重明显下降，而肝体比增加，血清酶学指标水平显著上升（ALT、AST、LDH），小鼠肝脏组织病理损伤性改变明显，说明腹腔注射DMN对小鼠肝脏可造成一定的急性损伤。而与DMN组相比，DPPD各组小鼠血清酶学指标水平显著下降，以上结果可证明预防性给予DPPD能有效地抵御DMN所造成的小鼠急性肝脏损伤。

DPPD主要通过激动Nrf2和抑制苯并芘的活性从而对Ⅱ相酶进行介导，减少DNA加合物的形成[14]，此外，DPPD可以降低小鼠肿瘤的发生率，减少息肉的发生[15]。小鼠体内试验证明，DPPD可通过抑制Akt信号通路从而抑制肿瘤的进展[16]，并且其可作为雌激素受体竞争剂减少二甲基苯蒽引起的乳腺DMN加合物的产生并降低乳腺肿瘤的发生率[17-19]。DPPD还通过调节AhR的功能，调节致癌物引起的Ⅰ相酶的表达和活化，体外实验中，其表现出一定的抗肝癌活性[20]。

在笔者以往的实验中[5]，观察到单独给予小鼠DPPD可以引起小鼠肝重和肝体比的增加，并且未观察到任何表现出毒性的指标变化。此外，有研究表明在长期给予小鼠DPPD后，可观察到肝重的增加，且喂养DPPD组小鼠健康情况与阴性组无显著差异[18]。由于DPPD可以会对CYP450产生一定的诱导，推测喂养DPPD后肝重的增加可能与CYP450被诱导后的适应性现象有关[21]。

GSH/GSSG反映了肝脏抵御氧化损伤的水平，是肝脏中最重要的抗氧化指标之一[21]。MDA是不饱和脂肪酸过氧化的终产物，肝脏组织中的MDA常作为评价肝脏氧化应激水平的生物指标[22]。由本实验室已有研究结果可证明，DPPD可以抵御包括二甲基甲酰胺、四氯化碳在内的多种化学物质造成的急性肝脏损伤[3-6，23]，这些保护作用主要是通过诱导谷胱甘肽合成等途径调动机体抗氧化系统从而发挥作用。由此推测DPPD对DMN造成的小鼠急性肝损伤的保护作用很可能是通过调动机体抗氧化应激系统来发挥作用。

为验证这一假设，在本实验中，留取小鼠肝脏进行处理，测定肝脏组织中MDA和GSH/GSSG水平。结果证明，单独注射DMN组小鼠肝脏MDA值水平显著增高，而DPPD各剂量组的MDA值则较DMN组均有所下降，并表现出一定的剂量反应关系。相比对照组，DMN组GSH/GSSG比值明显降低，初步推测是DMN进入体内后消耗了GSH，并刺激了GSSG合成增加，而给予DPPD各组相比，DMN组GSH/GSSG比值有所升高，这一结果可证明DPPD通过诱导体内GSH合成来抵御DMN造成的肝脏毒性。具体机制还需要进一步进行探索。

综上所述，DPPD能够有效抵御DMN造成的肝脏损伤可能是通过调动机体的抗氧化应激作用，但其更深的机制以及是否通过其他途径发挥作用仍需进一步的研究探索。

[参考文献]

[1] Hu C. Estrogenic activities of extracts of Chinese licorice（Glycyrrhiza uralensis）root in MCF-7 breast cancer cells [J]. Steroid Biochem Mol Biol，2009，113（3-5）：209-216.

[2] Huo HZ. Hepatoprotective and Antioxidant Effects of Licorice Extract against CCl（4）-Induced Oxidative Damage in Rats [J]. Int J Mol Sci，2011，12（10）：6529-6543.

[3] 吕艳，丁兆丰，马秋霞，等.1，3-二苯-1，3-丙二酮对可卡因致小鼠肝毒性及神经毒性的保护作用[J].中国药物依赖性杂志，2011，20（2）：87-92.

[4] 李庆伟，邢国振，王富强，等.二苯甲酰甲烷对对乙酰氨基酚所致MT小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2009，23（1）：55-59.

[5] 王德伟，贾凤兰，阮明，等.二苯甲酰甲烷对二甲基甲酰胺致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2007，21（3）：235-240.

[6] 贾凤兰，赵琦，张祝琴，等.1，3-二苯-1，3-丙二酮对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国新药杂志，2006，15（1）：26-29.

[7] Haggerty HG，Holsapple MP. Role of metabolism in dimet hylnitrosamine-induced immunosuppression： a review [J]. Toxicology，1990，63（1）：1-23.

[8] Jin YL. Tissue remodeling following submassive hemorrhagic necrosis in rat livers induced by an intraperitoneal injection of dimethylnitrosamine [J]. Virchows Arch，2003， 442（1）：39-47.

[9] Lai DY. Role of dimethylnitrosamine-demethylase in the metabolic activation of dimethylinitrosamine [J]. Chem Biol Interact，1979，28（1）：107-126.

[10] George J. Dimethylnitrosamine-induced liver injury in rats： the early deposition of collagen [J]. Toxicology，2001，156（2-3）：129-138.

[11] Oyaizu T. Studies on the mechanism of dimethylnitrosam ine-induced acute liver injury in mice [J]. Exp Toxicol Pat hol，1997，49（5）：375-380.

[12] Yasuda M. Differentiation of necrotic cell death with or without lysosomal activation：application of acute liver injury models induced by carbon tetrachloride（CCl4）and dime thylnitrosamine （DMN） [J]. Histochem Cytochem，2000，48（10）：1331-1339.

[13] Lee M，Yoon S，Moon JO. The flavonoid naringenin inhibits dimethylnitrosamine-induced liver damage in rats [J]. Biol Pharm Bull，2004，27（1）：72-76.

[14] Thimmulappa RK. Dibenzoylmethane activates Nrf2-dependent detoxification pathway and inhibits benzo（a）pyrene induced DNA adducts in lungs [J]. Med Chem，2008，4（5）：473-481.

[15] Cheung KL. Differential in vivo mechanism of chemoprevention of tumor formation in azoxymethane/dextran sodium sulfate mice by PEITC and DBM [J]. Carcinogenesis，2010，31（5）：880-885.

[16] Khor TO. Dietary feeding of dibenzoylmethane inhibits prostate cancer in transgenic adenocarcinoma of the mouse prostate model [J]. Cancer Res，2009，69（17）：7096-7102.

[17] Lin CC，Ho CT，Huang MT. Chemopreventive effect of dibenzoylmethane on mammary tumorigenesis [J]. Dietary Supplements，2008，10：281-292.

[18] Lin CC. Inhibition by dietary dibenzoylmethane of mammary gland proliferation，formation of DMBA-DNA adducts in mammary glands，and mammary tumorigenesis in Sencar mice [J]. Cancer Lett，2001，168（2）：125-132.

[19] Lin CC，Ho CT，Huang MT. Mechanistic studies on the inhibitory action of dietary dibenzoylmethane，a beta-diketone analogue of curcumin，on 7，12-dimethylbenz[a]anthracene-induced mammary tumorigenesis [J]. Proc Natl Sci Counc Repub China B，2001，25（3）：158-165.

[20] MacDonald CJ，Ciolino HP，Yeh GC. Dibenzoylmethane modulates aryl hydrocarbon receptor function and expression of cytochromes P450 1A1，1A2，and 1B1 [J]. Cancer Res，2001，61（10）：3919-3924.

[21] Boelsterli UA. Mechanistic Toxicology [M]. Florida： CRC Press Inc，2007：399.

[22] Rio DD，Stewart AJ，Pellegrini N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress [J]. Nutr Metab Cardiovas Dis，2005，15：316-328.

[23] 阮明，张祝琴，贾凤兰，等.1，3-二苯-1，3-丙二酮对硫代乙酰胺致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国新药杂志，2006，15（8）：598-600.

（收稿日期：2013-12-05 本文编辑：程 铭）