响应面法优化纤维素酶辅助提取青蒿素的工艺研究

[摘要] 目的 优化纤维素酶提高青蒿素提取率的反应条件。 方法 应用响应面实验方法采用中心组合实验设计研究酶反应过程中时间、加酶量、温度对提取率的影响，并对提取工艺条件进行优化。 结果 纤维素酶辅助提取青蒿素的最优工艺条件：酶反应时间2.9 h，酶添加量0.20 g，反应温度42.6℃。 结论 响应面试验方法能够有效提高纤维素酶辅助提取青蒿素的提取率。

[关键词] 青蒿素；纤维素酶；提取；响应面

[中图分类号] R94 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）01（a）-0004-03

青蒿素（Artemisinin）是从菊科植物黄花蒿（Art-emisia annua L.）的干燥地上部分提取分离得到[1]，因其含有过氧基团的倍半萜内酯结构，使其对疟疾具有“高效、速效、低毒”的突出疗效[2]，被世界卫生组织（WHO）称为“世界上唯一有效的疟疾治疗药物”。尽管青蒿素的化学合成、生物合成及组织培养相继成功，但由于其产率低、成本高而难以投入工业化生产。青蒿素药物的生产主要依靠从天然青蒿中提取[3]。工业化青蒿素提取方法中应用最广的是常规有机溶剂提取法[4]，常用溶剂包括乙醇、溶剂汽油和石油醚等[5]。由于青蒿素在黄花蒿中含量低，常规有机溶剂提取法存在提取率低、耗时长、溶剂消耗大等问题[6]。近年来，一些用于天然产物提取的新技术不断涌现，如微波、超声波和酶技术等，取得了显著成效。其中酶技术具有反应效率高、条件温和、提取时间短、专一性强、易于控制和有效成分破坏少等优点[7]，是众多研究的热点。可用于辅助提取的酶的种类很多，纤维素酶是最常用的酶类之一，它能够水解纤维素-1，4-糖苷键，破坏细胞壁的致密结构，从而提高提取率，因而在中草药有效成分的分离提取方面取得了不少成果[8]。

我国是黄花蒿的主产国，资源丰富，植物提取青蒿素的产量占全球青蒿素产量的90%以上。将酶技术应用于青蒿素的提取过程，对提高青蒿素的提取效率、充分利用资源有重要意义。本研究考察了纤维素酶辅助提取青蒿素的条件，利用响应面试验分析酶反应过程各因素对提取率的影响，并优化酶辅助提取工艺，为纤维素酶在青蒿素提取工艺上的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1仪器与试药

FW135型中药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司），752型紫外-可见分光光度计（上海菁华科学仪器有限公司）。

青蒿药材购于广州市清平中药材市场，经本校张小红讲师鉴定为菊科植物黄花蒿的干燥地上部分，药材经粉碎后过40目筛备用。纤维素酶Cellulase T4[来源于绿色木霉（Trichoderma viride）]购自天野酶制剂（上海）有限公司，比活力40 000 U/g（按滤纸崩解力，天野法计算）。青蒿素标准品（百灵威科技有限公司，纯度>98%）。无水乙醇、95%乙醇、氢氧化钠、乙酸和乙酸钠等试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 纤维素酶辅助提取青蒿素的方法 称取1 g粉碎后的青蒿样品置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH=4.5），先常温下浸泡10 min，再加入一定量的纤维素酶，然后在一定温度下水浴振荡进行酶反应。酶反应结束后抽滤，将滤饼置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml无水乙醇，在45℃下水浴振荡1 h，抽滤，取滤液测定青蒿素含量。

1.2.2 青蒿素含量的测定方法 青蒿素仅在紫外区203 nm处有较弱的末端吸收，但与碱反应后，生成一化合物Q292，该物质在292 nm处有最大吸收，可用紫外分光光度法检测[9]。取样品溶液0.5 ml加入95%乙醇4.5 ml，再加入0.2% NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加热30 min，取出快速冷却，在292 nm处测定吸光值，每组测定三个平行样品，取平均值。根据标准曲线换算出青蒿素含量。

1.2.3 响应面实验方法 响应面实验是通过对响应面等值线的分析，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间函数关系的一种统计方法。具有试验次数少、精度高等优点；同时还能够对各因子的交互作用进行评价，快速有效的确定最佳条件。其中包括多种设计方法，本研究利用Designexpert 7.0软件进行设计实验与分析，响应面实验采用中心组合设计。中心组合设计试验中每种因素取5种水平，以（-α、-1、0、1、α）编码（本实验中α=1.414）。本实验选取酶反应时间（A）、酶反应温度（B）和酶添加量（C）作为影响因素，中心组合实验的编码和水平见表1。

2 结果

2.1 青蒿素含量测定的标准曲线

精确称取青蒿素标准样品10 mg，溶于95%乙醇溶液，定容至100 ml容量瓶中，配制成0.1 g/L的标准溶液。分别取标准溶液0、1、2、3、4、5 ml，加95%乙醇溶液至5 ml，再加入0.2% NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加热30 min，取出快速冷却，在292 nm处测定吸光值，每组取三个平行样品，取平均值。以青蒿素样品浓度x（g/L）为横坐标，292 nm吸光值y为纵坐标作图，结果得线性方程为D292=1.065c+0.019（r2=0.9971）。

2.2 响应面实验结果

利用Designexpert 7.0软件设计的中心组合实验数n=12，实验设计表及结果如表2所示，实验次序为随机安排。

对中心组合实验的结果在Designexpert 7.0软件中进行方差分析（ANOVA），结果表明，模型的P=0.0096，表明模型显著。对因素的交互效应分析表明，A、C、BC和A2为显著影响因素，即酶反应时间、加酶量、酶反应温度与加酶量交互作用和反应时间的平方值为显著影响因素。模型相关系数r2=0.9979，表明模型在99.79%程度上能够解释酶辅助提取率与变量之间的关系。模型的校正相关系数Adj r2=0.9882，与r2的数值相接近表明模型预测值和实际实验结果具有良好的相关性。模型的变异系数（coefficient of variation，CV）为2.58%，表明模型的可信任程度高。

由实验结果分析导出模型的二次方程：提取率R=2.34+0.19×A-0.042×B+0.70×C+0.15×A×B-0.035×B×C+0.17A2+0.031×B2-0.077×C2。利用Designexpert 7.0软件得出模型预测最大值为3.24，此时酶反应时间为2.94 h，酶反应温度为42.62℃，酶添加量为0.199 g。对模型的预测值进行验证，取酶反应时间2.9 h，酶反应温度42.6℃，酶添加量0.2 g，进行三次平行试验，得到青蒿素提取率的平均值为3.27 mg/g，验证实验的提取率与预测值基本吻合，表明优化模型能够很好地说明酶反应各因素与提取率之间的关系。与未采用酶辅助提取时的提取率1.13 mg/g相比，优化后酶辅助提取青蒿素的方法提高了1.89倍，表明酶辅助提取能有效提高青蒿素的提取率。

3 讨论

青蒿素主要存在与青蒿植物的茎叶组织中[2]，试验结果显示，纤维素酶Cellulase T4作用于青蒿能够提高其中青蒿素的提取率，表明恰当地利用纤维素酶处理能够克服植物组织中纤维素的屏障作用，利于有效成分的溶出[10]。影响纤维素酶水解植物细胞壁反应的主要因素包括酶用量、酶反应温度和酶反应时间等[10]，本研究利用响应面实验进行分析，并对酶辅助提取青蒿素工艺中各显著影响因素进行优化，优化条件下青蒿素的提取率较未使用酶辅助提取工艺提高了1.89倍。本研究将纤维素酶应用于青蒿素辅助提取方面，显著提高了青蒿素的提取率，为酶技术在中药制药领域的研究和应用提供了参考。

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（收稿日期：2013-09-10 本文编辑：林利利）