多成分药物序贯代谢方法用于川芎水煎液多成分不同阶段吸收代谢研究

[摘要]中药作为多成分药物，其代谢与吸收相关性问题，可以通过序贯代谢方法开展，并为生物药剂学分类系统中决定吸收的肠渗透性成分选择提供遴选依据。该研究以川芎为研究载体，采用在体封闭肠环的实验方法，并且结合液质联用技术对川芎水煎液中的多成分口服给药吸收和序贯代谢过程进行了研究。结果在川芎水煎液中鉴别了14个主要成分，其中阿魏酸，洋川芎内酯F，G，I，J，3羟基丁基苯肽6个成分以原型吸收入血，可作为中药生物药剂学分类系统中首选肠渗透性评价成分。正丁基苯酞，E藁本内酯，Z藁本内酯，新蛇床内酯，洋川芎内酯A，Q，在所有样品中均不存在，说明这6个成分不吸收或者在进入肝门静脉血前已经被代谢；洋川芎内酯H会被肝代谢；洋川芎内酯M会被肠道菌和肝代谢。通过这一研究，川芎水煎液多成分口服给药吸收代谢变化得以清晰展示出来，从而将静态的吸收入血成分转变为动态地、连续地、整体地多成分吸收代谢过程。

[关键词]多成分药物；药物代谢；序贯代谢；整体吸收；液质联用

[Abstract]The multiple components in Chinese herbal medicines （CHMS） will experience complex absorption and metabolism before entering the blood system Previous studies often lay emphasis on the components in blood However， the dynamic and sequential absorption and metabolism process following multicomponent oral administration has not been studied In this study， the in situ closedloop method combined with LCMS techniques were employed to study the sequential process of Chuanxiong Rhizoma decoction （RCD）. A total of 14 major components were identified in RCD Among them， ferulic acid， senkyunolide J， senkyunolide I， senkyunolide F， senkyunolide G， and butylidenephthalide were detected in all of the samples， indicating that the six components could be absorbed into blood in prototype Butylphthalide， Eligustilide， Zligustilide， cnidilide， senkyunolide A and senkyunolide Q were not detected in all the samples， suggesting that the six components may not be absorbed or metabolized before entering the hepatic portal vein Senkyunolide H could be metabolized by the liver， while senkyunolide M could be metabolized by both liver and intestinal flora This study clearly demonstrated the changes in the absorption and metabolism process following multicomponent oral administration of RCD， so as to convert the static multicomponent absorption process into a comprehensive dynamic and continuous absorption and metabolism process

[Key words]multicomponent drug； drug metabolism； sequential metablism； integral absorption； LCMS

doi：10.4268/cjcmm20160703

多成分药物代谢[12]由序贯代谢、并发代谢和多重代谢3部分组成。其中，序贯代谢是中药类多成分药物代谢研究的首要研究内容。中药生物药剂学分类系统[3]的构建坚持以多成分为整体，并注重每种成分受其他成分的影响，在发展过程中逐渐加大成分代谢对吸收的影响研究，生物药剂学分类系统中的肠渗透性评价量化指标是终点性评价，但中药的多成分在吸收前，需先面对消化液、消化酶、肠内细菌酶、内源性酶及自由基反应等引起的生物转化，在透过胃肠道生物膜时，也有被上皮细胞中的药物代谢酶生物转化的可能[4]，这些原因中哪个因素主导引起肠渗透性变化是阐述中药生物药剂学分类属性变化机制的重要方面。因此本研究采用多成分药物代谢序贯代谢研究方法进行，力争为中药生物药剂学分类系统中的肠渗透性评价提供代谢原因阐述。

多成分药物发挥药效是多种成分面对多个靶点的综合作用[5]，这些成分到达靶点的代谢过程决定了它们产生疗效的可能性，因此天然多成分药物的多种成分代谢动态过程研究已经发展成为一个热点科研方向[6]。目前单一成分代谢研究比较成熟[7]，2种成分之间的代谢性相互作用也阐述清晰[8]，但是将2种以上多成分作为整体研究代谢轮廓的方法还较少见，所以本研究坚持多成分同时测定的原则，按照口服多成分药物的消化道历程，开展多成分总体代谢轮廓研究，采用对照比较法依次进行。①消化液及消化酶代谢：分别在人工胃液、人工肠液的酸碱物理环境及消化酶作用下多成分是否发生代谢转化。②肠道菌群代谢：对比在有无肠道菌情况下多成分代谢情况。③肠壁代谢：对比在有无肠壁细胞内代谢酶抑制剂情况下多成分代谢情况。④肝代谢研究：对比肝门静脉血和腹主动脉血的多成分差异，阐述在肝内代谢情况。因4个过程在空间和时间上保持连续性，因此命名为“序贯代谢”。

川芎是高频使用的传统常用中药[9]，课题组前期已经运用高效液相色谱法对川芎多成分序贯过程进行了研究[10]，该研究中表明以色谱峰为代表的川芎多成分中，原型吸收种类较多，代谢转化种类相对较少。本论文在前期研究基础上，运用在体封闭肠环法结合液质联用技术，定性分析成分类型，系统阐述川芎多成分的肠道菌群代谢、肠壁代谢和肝代谢的序贯过程，并遴选出以原型吸收为主的成分作为下一步中药生物药剂学分类系统中肠渗透性评价的首选成分。

1材料

Thermo 液质联用系统（美国赛默飞世尔科技），包括ultimate 3000高效液相色谱仪，自动进样器，DAD检测器，柱温箱，二元泵和LTQ Orbitrap质谱；Xcalibur， Metworks和 Mass Frontier 70用于数据采集和处理；电子分析天平（BT25S，北京赛多利斯仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（DZKW4，北京中兴伟业仪器有限公司）；超声波清洗器（KQ500DE，昆山超声仪器有限公司）；115PK离心机（德国Sigma 公司）；蠕动泵（BT1001F，保定兰格恒流泵有限公司）；QL901漩涡混和机（其林贝尔仪器制造公司）。

川芎饮片（购买于北京同仁堂药店）经北京中医药大学张贵君教授鉴定为伞形科藁本属植物川芎Ligusticum chuanxiong的干燥根茎；对照品阿魏酸（Aladdin，纯度99%，批号F1110835g）、藁本内酯（中检院，纯度≥98%，批号ZJ0724BB13），对照品洋川芎内酯A（纯度≥98%，批号140914）、洋川芎内酯Ⅰ（纯度≥98%，批号141027）和正丁基苯酞（纯度≥98%，批号130907）购于成都普菲德生物技术有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯，Fisher公司），1氨基苯并三唑（北京百灵威有限公司），娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。其余试剂均为分析纯。

SD大鼠，雄性，体重280～330 g，斯贝福（北京）实验技术有限公司提供，许可证号SYXK（京）20110024，动物饲养于北京中医药大学实验动物部标准屏障环境内，自由饮食，明暗节律12 h/12 h。实验前适应性喂养大鼠1周以上，自由饮水和进食。

2方法

21溶液配制

211KrebsRinger′s营养液（KR液）配制称取NaCl 780 g，KCl 035 g，CaCl2 037 g，NaHCO3 137 g，NaH2PO4 032 g，MgCl2 002 g，葡萄糖140 g；加蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH到739～741，放置备用。

212川芎水煎液的制备取川芎饮片100 g，精密称定，置具有冷凝回流装置的圆底烧瓶中，加1 000 mL去离子水，浸泡1 h后回流提取15 h，趁热过滤出提取液。再向烧瓶中加入1 000 mL去离子水，回流提取1 h，趁热过滤出提取液。合并提取液。滤液经过水浴浓缩，并用KR液定容至100 mL，制成含生药1 g・mL-1的溶液，作为灌肠药液。取适量水提液加蒸馏水制成相当于药材质量浓度为10 g・L-1溶液，用022 μm滤膜过滤，取续滤液进行液质分析。

213对照品的配制分别精密称取适量阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯I、正丁基苯酞对照品于10 mL量瓶，甲醇溶解稀释为质量浓度约为10 mg・L-1的对照品溶液进行液质分析。

22实验动物手术方法

221肠道菌代谢研究15只SD大鼠禁食12 h，自由饮水，分为2组，12只为供血组，3只为实验组，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，实验组腹主动脉取血，血液放于肝素化离心管置于37 ℃水浴锅中保温。在实验组大鼠颈静脉插管输血，保证实验过程的血液损失得到补充，肠系膜静脉插管收集血液。沿其腹中线打开腹腔约3～4 cm选取结肠，在肠段首末端事先系上丝线，用注射器将药液注入肠腔。当药液到达肠段末端，用丝线结扎，然后取下注射器并结扎肠段前段。通过蠕动泵从颈静脉给实验鼠供血。在蠕动泵另一端开始收集血液，同时结扎门静脉，待实验完成后，收集肠道内药液。

无肠道菌实验手术方法与有肠道菌实验相同，不同之处在于药液被注入小肠前，于小肠末端切一横向口，用温热的生理盐水洗净肠内容物后再进行后续操作。实验持续15 h，收集的血液放入肝素化的离心管中，4 000 r・min-1离心10 min，取上清液加入3倍量甲醇，涡旋2 min，1万 r・min-1离心10 min，取上清液过045 μm滤膜，进行液相分析。

222肠壁酶代谢研究采用无肠菌实验的手术方法。唯一不同的是在多成分药液注入肠道循环前，非特异性CYP450酶抑制剂1氨基苯并三唑需要加入到冲洗液和药液中。1 h后肠系膜静脉收集18 mL血样，处理方法同肠道菌实验。

223肝代谢研究肝代谢后多成分进入血液系统，此实验也是采用封闭肠环法，将川芎药液封闭在结肠，不需要供血，不结扎门静脉，在1 h后腹主动脉采血约10 mL，样品处理同肠道菌实验。

23液相和质谱条件

色谱条件：采用Thermo Bos Hypersil C18色谱柱（21 mm ×150 mm， 24 μm），流动相003%甲酸水（A）甲醇（B），梯度洗脱（0～3 min，20%～25% B；3～7 min，25%～58% B；7～10 min，58%～60% B；10～15 min，60%～65% B；15～20 min，65%～80%B；20～24 min，80%～80% B），流速035 μL・min-1，柱温30 ℃，检测波长280 nm，进样量2 μL。

质谱条件：ESI源，正离子模式检测，喷雾气压34474 kPa，干燥气（N2）流速 50 L・min-1，干燥气体温度 330 ℃，气化室温度为 350 ℃，毛细管电压+4 000 V，电晕放电电流正离子模式为40 μA，破碎电压（Fragmentor）为100 V；扫描范围100～1 000。

3结果

31川芎水煎液中主要成分液质联用分析

采用23下的色谱条件能够对川芎水煎液的成分实现较好的分离，见图1，对色谱图进行分析，结果表明川芎中主要成分为内酯类成分或酚酸类成分。对各色谱峰进行了串联质谱分析，结果见表1。

化合物1一级质谱准分子离子峰为m/z 195[M+H]+，二级质谱中有m/z 177为[M+H-H2O]+的碎片离子峰，与阿魏酸对照品数据一致，故化合物1为阿魏酸。

化合物2一级质谱准分子离子峰为m/z 227[M+H]+，推测相对分子质量为226，最大吸收波长为279 nm，与文献[11]报导的洋川芎内酯J相符，证明该化合物为洋川芎内酯J。

化合物3和4的质谱图相似，只是质谱响应丰度略有不同。在一级质谱准分子离子峰为m/z 247[M + Na]+，证明该化合物的相对分子质量为224。二级质谱中均存在m/z 207[M+H-H2O]+，189[M+H-2H2O]+等特征碎片离子，其UV最大吸收波长为277 nm，保留时间、质谱数据和紫外数据均分别与洋川芎内酯I和H对照品一致，因此化合物3和4分别为洋川芎内酯I和H。

化合物5一级质谱准分子离子峰为m/z 229[M+Na]+，一级质谱中未出现m/z 207[M+H]+，推测该化合物相对分子质量为206，二级质谱中存在m/z 189[M+H-H2O]+，161[M+H-H2O-CO]+等碎片离子，其最大吸收波长为327 nm，与文献[11]报导的洋川芎内酯F相符，推测该化合物为洋川芎内酯F。

化合物6一级质谱准分子离子峰为m/z 229[M+Na]+，207[M+H]+证明该化合物相对分子质量为206，二级质谱中存在m/z 189[M+H-H2O]+，161[M+H-H2O-CO]+等碎片离子，其质谱数据与文献[12]报导一致，推测该化合物为3羟基丁基苯酞。

化合物7一级质谱准分子离子峰为m/z 209[M+H]+，231[M+Na]+，推测其相对分子质量为208，在二级质谱中存在m/z 191，173，163，145等类似于内酯类的碎片离子，其UV最大吸收波长为279 nm，与文献[9]报导的洋川芎内酯G相符，因此化合物7推测为洋川芎内酯G。

化合物8一级质谱中准分子离子峰为m/z 193[M+H]+，同时还有m/z 215[M+Na]+，推测其相对分子质量为192，其二级谱产生m/z 175[M+H-H2O]+，147[M+H-H2O-CO]+等碎片离子，其UV最大吸收波长为279 nm，质谱数据和紫外数据均与洋川芎内酯A对照品一致，因此化合物8为洋川芎内酯A。

化合物9，10和12一级质谱具有相同的准分子离子峰m/z 191[M+H]+，化合物9二级质谱产生碎片峰m/z 173[M+H-H2O]+，145[M+H-H2O-CO]+，其UV最大吸收波长为275 nm，经与对照品比对，化合物9确定为正丁基苯酞。化合物10和12有相同的裂解碎片，所以推测是顺反异构体。其二级质谱中除了有m/z 173，145外，还有m/z 163[M+H-CO]+，155[M+H-2H2O]+，149[M+H-C3H6]+，117[M+H-H2O-CO-C2H4]+等碎片峰，其UV最大吸收波长在278 nm，与文献[89]报道藁苯内酯一致。一般情况下，在C18柱中反式较顺式先出峰，所以化合物10为E藁苯内酯，化合物12为Z藁苯内酯。

化合物11和14质谱图相似，裂解碎片均相同，推测为同分异构体。一级质谱中产生分子离子峰m/z 279[M+H]+，推测相对分子质量为278。同时二级质谱产生m/z 261[M+H-H2O]+和233[M+H-H2O-CO]+等类似于内酯类的裂解碎片，根据元素组成分析该化合物分子式为C16H22O4，相对分子质量实测值为279158 29，与理论值279159 09相差28，其UV最大吸收波长在278 nm，与文献[9]报导洋川芎内酯M和Q数据类似，故暂时推测化合物11和14分别为洋川芎内酯M和Q。

化合物13一级质谱中产生准分子离子峰m/z 195[M+H]+，二级裂解质谱中产生m/z 177[M+H-H2O]+和149 [M+H-CO]+的碎片峰。根据元素组成分析该化合物分子式为C12H18O2，相对分子质量实测值为195137 3，与理论值195137 9相差34 ppm，与文献[9]报道的新蛇床内酯的结构相同，故化合物13推测为新蛇床内酯。

32川芎水煎液多成分吸收与序贯代谢研究

由于前期结果已经表明川芎多成分在人工胃液和人工肠液中稳定性良好[7]，因此继续运用液质联用技术对川芎多成分在肠壁、肠道菌群和肝脏3个部位序贯过程的吸收和代谢进行了研究，结果见表2。

由表中数据分析可知，阿魏酸，洋川芎内酯J，I，F，G，3羟基丁基苯肽在所有样品中均存在，说明这6个成分可以一直以原型的形式吸收入血；正丁基苯酞，E藁本内酯，Z藁本内酯，新蛇床内酯，洋川芎内酯A，Q，在所有样品中均不存在，说明这6个成分不吸收或者在进入肝门静脉血前已经被代谢；洋川芎内酯H在肝代谢的样品中不存在，说明其会被肝代谢；洋川芎内酯M在有菌样品和肝代谢样品中不存在，而在其他2个样品中存在，说明其会被肠道菌和肝代谢。

4讨论

由实验结果可知，阿魏酸，洋川芎内酯J，I，F，G，3羟基丁基苯肽这6个成分能以原型吸收入血，并在序贯代谢的各个阶段均不代谢，可作为中药生物药剂学分类系统中首选肠渗透性评价成分。正丁基苯酞，E藁本内酯，Z藁本内酯，新蛇床内酯，洋川芎内酯A，Q这6个成分因其难以在肝门静脉中查见，所以不适于选择作为肠渗透性评价成分。洋川芎内酯M在肠道内可被菌群代谢，其吸收情况受菌群影响不稳定，难以找到包含肠道菌群影响因素的实验手段，不适宜作为中药生物药剂学分类系中的肠渗透性评价成分。洋川芎内酯H可以原型吸收后只在肝发生代谢，可用于作为肠渗透性评价的可选成分，但该成分肝代谢转化效率及产物与原型化合物定量吸收回溯问题十分复杂，只能作为肠渗透性评价的备选方案。

通过川芎多成分序贯代谢过程动态追踪研究，可全面地、完整地、系统地描述多成分吸收代谢轮廓。多成分吸收代谢一直是科学研究的难点，但作为中药的用药特点，又是不可回避的内容。随着近年来肠道首过代谢越来越受到研究人员的重视[13]，对于多成分药物肝肠吸收代谢的差异性及连续性描述也变得越来越重要。因此，在研究中应该坚持多成分同时测定的原则，并注重过程的序贯衔接的整体性，才能使多成分为支撑的中药生物药剂学分类系统中肠渗透性评价成分选择更具科学性。

[参考文献]

[1]刘洋，潘艳丽，王晶娟，等. 多成分药物代谢理论及技术方法分析 [J].中草药，2014，45（12）：1663.

[2]刘洋，翟华强，赵保胜，等. 多成分药物代谢学术思想在中医临床药学研究中的应用分析[J]. 中国中药杂志，2014，39（7）：1335.

[3]刘洋，隗丽，董玲，等. 多成分体系下中药生物药剂学分类系统的构建分析[J]. 中国中药杂志，2014，39（23）：4479.

[4]何雪莲，秦付林，任华忠. 中药复方药效物质基础研究方法探析[J]. 亚太传统医药，2009（3）：3.

[5]Keith C T，Borisy A A，Stockwell B R. Multicomponent therapeutics for networked systems[J]. Nat Rev Drug Discov，2005，4（1）：71.

[6]杨秀伟. 中药新药有效成分研究及其标准制定的科学依据[J]. 中草药，2009 （S1）：8.

[7]Xiang C，Qiao X，Wang Q，et al. From single compounds to herbal extract：a strategy to systematically characterize the metabolites of Licorice in rats[J]. Drug Metab Dispos，2011，39（9）：1597.

[8]Lin H L，Zhang H，Medower C，et al. Inactivation of cytochrome P450 （P450） 3A4 but not P450 3A5 by OSI930，a thiophenecontaining anticancer drug [J]. Drug Metab Dispos，2011，39（2）：345.

[9]朱善珍. 各种中药材的使用频率及质量控制的调查分析[J]. 江苏药学与临床研究，1996（2）：44.

[10]吕贝然，杨文宁，唐明敏，等. 大鼠体内川芎多成分序贯代谢研究[J]. 中国中医药信息杂志，2015，4（4）：77.

[11]Tao Y，Kelvin S Z E，Yin L，et al. Simultaneous qualitative and quantitative analyses of the major constituents in the rhizome of Ligusticum chuanxiong using HPLCDADMS[J]. Chem Pharm Bull，2006，54（2）：255.

[12]Aihua Z，Li W，Hongbin X，et al. Identification of the absorbed components and metabolites in rat plasma after oral administration of Rhizoma Chuanxiong decoction by HPLCESIMS/MS[J]. J Pharm Biomed Anal， 2011，56（5）：1046.

[13]Wu C Y，Benet L Z，Hebert M F，et al. Differentiation of absorption and firstpass gut and hepatic metabolism in humans：studies with cyclosporine[J]. Clin Pharmacol Ther，1995，58（5）：492.