临床用量的复方黄黛片及大剂量雄黄对大鼠肝脏主要药物代谢酶的影响

[摘要]探究临床用量的复方黄黛片及大剂量君药雄黄对大鼠肝脏主要药物代谢酶（CYP450）酶活性的影响及在mRNA水平的调控作用。以Wistar大鼠为研究对象，受试药物给予14 d后，采用Cocktail体外孵育法结合HPLC-MS/MS技术对大鼠肝中CYP1A2，CYP2B，CYP3A，CYP2C各亚酶的活性进行测定，并利用实时荧光定量PCR技术对上述亚型的mRNA水平表达进行检测。结果显示，复方黄黛片显著诱导CYP1A2，CYP2B酶活性，抑制CYP3A酶活性，结果与mRNA的表达具有一致性，但其单味药却呈现出弱于其甚至是相反的现象；不同剂量的雄黄组之间对酶活性及mRNA的表达结果亦呈现非常显著的不一致性。这些现象可能与复方黄黛片的配伍增效或减毒有关。CYP450酶的研究结果亦可以提示，复方黄黛片与其他药物合用时有可能产生药物相互作用。

[关键词]复方黄黛片； 雄黄； 细胞色素P450； 肝微粒体； 酶活性

[Abstract]To investigate the effect of clinical dose of Realgar-Indigo Naturais formula （RIF） and large-dose of Realgar on main drug-metabolizing enzymes CYP450s of rat liver， as well as its regulatory effect on mRNA expression. Wistar rats were administrated orally with tested drugs for 14 days. A Cocktail method combined with HPLC-MS/MS was used in the determination of 4 cytochrome P450 isozymes （CYP1A2， CYP2B， CYP3A and CYP2C） in liver of the rats， and the mRNA expression levels of the above subtypes were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The results showed that RIF can significantly induce CYP1A2 and CYP2B enzyme activity， and inhibit CYP3A enzyme activity. This result was consistent with the mRNA expression. However， its single compound showed weaker or even contrary phenomenon. Different doses of Realgar also showed significant inconsistencies on CYP450 enzymes activity and mRNA expression. These phenomena may be relevant with RIF compatibility synergies or toxicity reduction. The results can also prompt drug interactions when RIF is combined with other medicines in application.

[Key words]Realgar-Indigo Naturalis formula； realgar； cytochrome P450； liver microsome； enzyme activity

细胞色素P450（cytochrome P450， CYP450）氧化酶系统是参与机体绝大多数药物、外源性物质和内源性物质进行Ⅰ相氧化代谢的主要酶类[1-2]，临床使用的药物有90%以上由其代谢[3]。因此，该酶在药物代谢以及药物相互作用的研究中有着重要地位。近年来，由于中药应用推广呈现良好态势，而药源性损害事件也屡有报道[4]，因此，基于P450酶系统的中药与其活性成分以及组分配伍的安全性和疗效研究具有十分重要的意义 [5-7]。对确有疗效的有毒中药的相关研究更为重要。

含砷制剂（雄黄、砒霜）在临床治疗急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia， APL）时表现出较好的疗效[8-9]，复方黄黛片（RIF）就是含砷制剂的主要代表药物。其由国医大师黄世林发明，由雄黄、青黛、丹参和太子参组成，临床主治为清热解毒，益气生血，用于初治的APL，疗效显著。复方黄黛片中君药雄黄作为确有疗效的有毒中药，尤为受到关注。目前对复方黄黛片的研究大多聚焦于临床及药理作用的分子机制，因此，本实验针对CYP450酶系统，通过观察给药后大鼠体重、血液指标、CYP各亚酶酶活性水平及mRNA转录水平等的变化，初步探究临床用量的复方黄黛片与其各组分以及大剂量君药雄黄对大鼠肝脏主要药物代谢酶的影响。

1 材料

1.1 药品与试剂

复方黄黛片（每片含水飞雄黄39.2 mg，青黛90.4 mg，丹参108.0 mg，太子参32.4 mg，硬脂酸镁2.7 mg）由安徽省天康药业有限公司生产，生产批号150402；水飞雄黄购于北京华邈中药工程技术开发中心，由军事医学科学院放射与辐射医学研究所马百平研究员鉴定；青黛、丹参、太子参均购自北京同仁堂药业股份有限公司；CYP同工酶CYP1A2，CYP2B6，CYP3A4，CYP2C9的特异性底物以及相代谢产物的标准物质非那西丁/对乙酰氨基酚（phenacetin/acetaminophen）、安非他酮/羟基安非他酮（bupropion/hydroxybupropion）、咪达唑仑/1′-羟基咪达唑仑（midazolam/1′-hydroxymidazolam）、甲苯磺丁脲/4-羟基甲苯磺丁脲（tolbutamide/4-hydroxytolbutamide）来源于USP标准物质或Sigma公司；NAPDH购于Roche公司；盐酸普萘洛尔标准物质购于中国食品药品检定研究院；甲醇和乙腈均为色谱级，购于Fisher公司；Ultra RNA提取试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒均购于CWBIO公司；逆转录、聚合酶链式反应试剂盒为TransScript公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 分组及给药

雄性Wistar大鼠（SPF级），体重（200±10） g，由军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号SCXK（军）-2012-0004。大鼠给予标准饲料和水，饲养于军事医学科学院27号院动物实验室，12 h日夜节律。饲养3 d后利用SAS随机分组程序根据体重随机分为正常对照组（NC组）、苯巴比妥组（PB组）、复方黄黛片组（RIF组）、雄黄临床用量组（RCD组）、雄黄大剂量组（RLD组，为雄黄临床用量的20倍）、青黛临床用量组（QD组）、丹参临床用量组（DS组）、太子参临床用量组（TZS组），每组8只。各实验组剂量依据复方黄黛片临床使用剂量设置，并折算成大鼠的等效剂量。其中NC组灌胃纯净水；PB组于实验结束前3 d连续腹腔注射给予苯巴比妥溶液，剂量为80 mg・kg-1・d-1；RCD组（104.4 mg・kg-1・d-1）、RLD组（2 088.0 mg・kg-1・d-1）、QD组（241.2 mg・kg-1・d-1） 3个组别的药材水飞雄黄和青黛成品均为超细粉，按照上述剂量计算，直接称取药材粉末适量，配制成所需浓度的混悬液即可；RIF组（720.0 mg・kg-1・d-1）和TZS组（86.4 mg・kg-1・d-1）的药物分别粉碎后研成细粉，过100目筛后加纯净水制成混悬液；DS组（288.0 mg・kg-1・d-1）供试液制备方法为：精密称取丹参，加10倍量纯净水，煎煮4次，每次2 h，滤液合并，52 ℃减压浓缩至所需浓度。灌胃给药（5 mL・kg-1），连续14 d，于第15天处死动物，采血用于血液分析和血清生化分析，取肝脏并制备肝微粒体。

2 方法

2.1 动物体重

于分组时、给药前、给药第7天和解剖前分别称量各组动物体重。

2.2 血象和血清生化指标检测

采用Sysmex 2000i型血细胞分析仪检测大鼠常规血象，另采用日立7180型生化分析仪分析丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、总胆红素（TBIL）、肌酐（CREA）等生化指标。

2.3 cocktail 探针法测定各实验组对大鼠肝脏CYP450酶活性水平的影响

2.3.1 肝微粒体的制备 肝微粒体的制备采用差速离心法[10]。大鼠禁食不禁水12 h，颈椎脱臼处死，迅速剪开腹腔，腹腔静脉采血，结扎上腔静脉，用4 ℃生理盐水由门静脉灌洗至肝脏呈土黄色。将肝脏剪碎，按1∶4加入TMS缓冲液（Tris-base 12.11 g，MgCl2・6H2O 1.21 g，蔗糖137 g，溶于2 L超纯水中，浓盐酸调节pH至7.5，储存于4 ℃备用），冰浴中匀浆，匀浆液于4 ℃，12 000×g离心20 min，弃沉淀，留上清。上清液于4 ℃，105 000×g离心60 min，弃上清，沉淀部分即为所需的肝微粒体。按初始匀浆时每克肝组织加入1 mL Tris-HCl储存液（Tris-base 12.12 g，EDTA-2Na 0.37 g，加入蒸馏水800 mL，浓盐酸调节pH为7.5，加入200 mL甘油混合均匀，储存于4 ℃备用），重悬微粒体，冰浴，玻璃匀浆管手动匀浆，使肝微粒体分散均匀，分装于冻存管中，-80 ℃保存。微粒体蛋白浓度采用BCA法定量，定量方法参照BCA蛋白定量试剂盒。

2.3.2 肝微粒体孵育体系 同时检测4种主要的CYP450亚型（CYP1A2，CYP2B6，CYP3A4，CYP2C9）活性变化。孵育体系总体积200 μL，其中肝微粒体蛋白总质量浓度为0.5 g・L-1，NADPH终浓度为1 mol・L-1，CYP450特异性探针药物浓度依次为非那西丁（10 μmol・L-1）、安非他酮（25 μmol・L-1）、甲苯磺丁脲（25 μmol・L-1）、咪达唑仑（2.5 μmol・L-1），不足部分以K2HPO4/KH2PO4缓冲液（0.05 mol・L-1，pH 7.4）补足体系至200 μL。在37 ℃水浴中预孵育5 min，加入同时预孵育5 min的NAPDH启动反应，继续孵育30 min。孵育完成后加入冰冷的由甲醇-乙腈（1∶1）配制的含内标盐酸普萘洛尔800 μg・L-1的终止剂溶液200 μL停止反应，涡旋1 min，13 000×g，4 ℃离心20 min，取上清液进样检测，测得酶活性。

2.3.3 代谢产物HPLC-MS/MS检测条件[11] 色谱条件：流动相A（含0.1%甲酸和5 mmol・L-1甲酸铵的纯水），流酉B（含0.1%甲酸的乙腈），梯度洗脱，0～1.5 min，30%B，1.5～3.5 min，30%～95%B，3.5～3.6 min，95%～30%B，3.6～4.5 min，30%B，流速0.45 mL・min-1；柱温25 ℃；进样体积10 μL。

质谱条件：以电喷雾电离离子源（ESI源），采用质谱多级反应检测（multiple reaction monitoring， MRM）方式检测，毛细管电压4 000 V，毛细管温度320 ℃，雾化电压25 psi（1 psi=6.895 kPa），干燥气流速10 L・min-1，其他质谱分析参数见表1。

2.4 荧光定量PCR技术测定各受试物对大鼠肝脏CYP450酶mRNA水平的影响

2.4.1 肝组织总RNA的提取 大鼠处死后迅速取出肝脏，至于液氮中预冻，-80 ℃保存。按CWBIO公司Ultra RNA提取试剂盒说明书提取肝脏总RNA。电泳分析表明18S和28S条带清晰可见，A260/A280在1.8～2.0，总RN段完整未降解，可用。

2.4.2 逆转录（RT）反应 RNA上样量为1 μg，依据测得的RNA浓度计算加入的体积，另加入2×TS Reaction Mix 10 μL，RT/RI Enzyme Mix 1 μL，Anchored Oligo（dT）18 1 μL，RNase-free Water补足反应体系至20 μL，混匀。逆转录条件为42 ℃，30 min，85 ℃，5 min，逆转录产物-20 ℃保存待用。

2.4.3 实时定量PCR（RT-qPCR）反应测定mRNA表达水平 RT-qPCR反应依据TransScript公司qPCR试剂盒说明书进行，反应总体系20 μL，分别为：逆转录产物cDNA 2 μL，2×TransStart Green qPCR SuperMix 10 μL，Forward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，Passive Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。RT-qPCR反条件为：94 ℃，30 s，94 ℃，5 s，60 ℃，30 s，循环40次，以GAPDH作为内参基因。mRNA表达水平用比较阈值法进行定量分析，所扩增的目的基因诱导或抑制的倍数=2-ΔΔCt，即RQ。单次试验平行3个复孔，实验重复3次。特异性引物序列见表2。

2.5 数据统计

数据用±s表示，采用SAS 8.1软件两因素析因设计的方差分析进行组间比较，采用Graphpad prism软件作图。

3 结果

3.1 对大鼠体重的影响

分组时和给药前各实验组动物体重一致，与正常对照组比较均无统计学差异；给药第7天时，与正常对照组相比，雄黄大剂量组体重偏小非常显著（P

3.2 对血象和血清生化指标的影响

对血象数据进行分析，与正常对照组比较，其余各实验组血象均无明显改变，其值均在大鼠血象正常参考范围内；对血清生化指标进行分析，结果显示，雄黄大剂量组表征肝脏功能的3个指标ALT，AST，ALP较正常对照组均有升高，P分别为0.07，0.07，0.03，雄黄临床用量组ALP与正常对照组比较显著升高，提示雄黄对肝脏功能可能存在潜在影响，后续相同剂量相同给药时间的另一批试验中，对主要脏器的组织病理学进行检查，发现雄黄大剂量组肝脏细胞出现轻微的细胞变性，其余主要脏器未见明显改变，结果见表4。

3.3 复方黄黛片和大剂量雄黄对大鼠肝微粒体CYP450酶活性的影响

结果显示临床用量的复方黄黛片及大剂量雄黄连续给药14 d后，与正常对照组比较，复方黄黛片组和大剂量雄黄组均能显著诱导CYP1A2酶活性（P

3.4 对CYP450酶各亚型mRNA表达的影响

结果显示：PB组作为阳性对照组可显著诱导各亚型mRNA的表达（P

4 讨论

在急性早幼粒细胞白血病的治疗中，复方黄黛片经常作为主药与全反式维甲酸、地西他滨、沙利度胺、维A酸等诸多药物合用[12-13]，由此可能产生的潜在药物相互作用不容忽视，本实验对CYP450酶的研究结果能在一定程度上对复方黄黛片与其他药物合用时有可能产生的药物相互作用提供启示。

在人体众多CYP亚型中，CYP1A2，CYP2C9，CYP2B，CYP3A4 4种亚型占到由P450酶介导的药物代谢的80%[14-15]。在本研究中，选择大鼠作为实验对象，尽管其和人类在CYP450酶的亚型种类，表达和催化活性上确实存在差异，但是其依然作为一种被推荐使用的动物模型用于预测药物在人体内的代谢行为。且理论上说，人体CYP亚型CYP1A2，CYP2C9，CYP2B6，CYP3A4与鼠CYP亚型CYP1A2，

CYP2C11，CYP2B1/2，CYP3A1相对应具有同源性[2]。与此同时，上述几种亚型在啮齿类动物的外源性物质活化与减毒过程中也扮演十分重要的角色。因此选择大鼠作为实验对象是合理的。

复方黄黛片对CYP1A2和CYP2B1/2 mRNA的表达均有显著诱导作用，与此同时，复方中的单味药却表现出弱于复方的诱导作用甚至抑制作用；对CYP2C11 mRNA的表达无诱导作用，但雄黄（临床用量）组、丹参组和太子参组却受到显著抑制；在CYP3A1 mRNA的表达上，各实验组均受到不同程度的显著抑制。大剂量雄黄组对CYP1A2，2B1/2，2C11 mRNA的表达有显著的诱导作用，对CYP3A1的表达有显著抑制作用，且抑制程度均高于其他实验组。已检测的酶活性数据也印证了上述结果。上述多个现象表明，复方黄黛片及其方中各组分对4种CYP酶mRNA的表达存在显著的不一致，这种不一致性可能是由方中各组分的协同或拮抗作用产生的。而且这一作用可能在转录环节就已经开始，并影响到酶活性。

基于CYP450酶的药物相互作用与中药组分配伍之间的毒效关系有着紧密联系，课题组前期用现代药理学方法证实了甘草“调和诸药”的科学内涵[7]，课题组发现甘草及其主要成分甘草酸对CYP3A均能产生明显的诱导作用，且确证了甘草效应成分通过与PXR受体结合，继而诱导CYP3A酶活性而加速了方剂中其他配伍中药有效成分的代谢而起到调节诸药，甚至是解毒的作用。本研究中，复方及单组分对CYP450酶活性及mRNA表达影响的不一致性，或许能从CYP450酶的角度揭示复方黄黛片组方的科学内涵。但这还有待下一步的深入研究。

为进一步研究君药雄黄对CYP450酶的影响，本实验设计了雄黄大剂量给药组。梁爱华[16]和陆远富[17]的研究均表明，科学评r雄黄的毒性，其剂量设置的合理范围应当在10～16倍。综合考虑，为避免在14 d给药期间出现过度不良反应，又期望能看到对大鼠的轻微损害，结合预实验结果，选择临床用量的20倍作为雄黄的大剂量组。结果显示，雄黄大剂量组大鼠体重增长速度明显低于其余实验组，且ALT，AST，ALP等指标均有明显改变。后续实验证实，此时已经有轻微的肝损害发生。基于此前提，分析雄黄大剂量组对CYP450酶活性及mRNA表达的影响，结果表明雄黄大剂量组与临床用量的雄黄组表现出显著差异，提示雄黄对CYP450酶的影响可能与剂量相关，且雄黄大剂量组在CYP3A酶活性和mRNA表达水平上均显著低于雄黄临床用量组，而CYP3A是药物代谢中最为重要的酶亚型，临床上60%的药物需经CYP3A代谢排出体外[18]，雄黄大剂量组出现肝脏细胞轻微变性，肝功能生化指标的改变可能与CYP3A酶活性受到抑制导致雄黄不能顺利排出体外而引起蓄积毒性有关。在本研究中，未设置线性剂量的雄黄组也是实验的不足之处，但本实验仍然为下一步的深入研究提供了可靠线索。且在后续研究中已经证实，雄黄随着剂量增大，对CYP3A酶的活性抑制增强，且具有线性相关，对其余3种CYP450酶活性其结果未呈现线性相关。相关实验结果已另文发表。

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