乳铁蛋白的分离纯化方法研究

摘 要：牛初乳中含有极丰富的生物活性物质，是提取和利用乳铁蛋白的最适来源之一。乳铁蛋白的分离纯化方法较多，本文概述了盐析和有机溶剂法、超滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法、吸附色谱法、固定化单克隆抗体法和混合模式扩张床吸附法等，就其工业化生产的前景进行了分析。

关键词：乳铁蛋白 分离纯化 方法

中图分类号：S5 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）04（b）-0002-02

20世纪40年代，从乳清蛋白中分离得到了一种含Fe3+红色蛋白，作为血清铁结合传递蛋白（TF）的类似物，称之为乳铁蛋白（1actoferrin，Lf），又称乳转铁蛋白，主要存在于大多数哺乳动物乳汁中的铁结合糖蛋白。Lf分子量约为80000u，多肽链上有两条糖链，包括半乳糖甘露糖N一乙酞半乳糖胺、岩藻糖以及涎酸等。由于Lf具有一些非凡的生理功能作用，能够促进铁吸收、广谱抗菌、免疫增强、抗病毒、抗癌等，所以应用高新技术对Lf的进行分离、纯化和综合利用的研究，成为食品界和乳品行业关心的热点问题。

人们采用各种各样的方法来分离提纯Lf，例如盐析和有机溶剂法、超滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法、吸附色谱法、固定化单克隆抗体法和混合模式扩张床吸附法等等。

1 盐析和有机溶剂法

根据蛋白等电点沉淀原理，Lf等电点为7.8～8.0，由于各种蛋白等电点范围交叉分布，所以很难将一种蛋白完全沉淀析出。曲练达等[1]用两次（NH4）2SO4和一次乙醇沉淀分离纯化Lf，纯度达45%左右。邬向东等[2]以饱和（NH4）2SO4盐析分离，经Sephadex G-100葡聚糖凝胶过柱纯化，并利用聚乙二醇浓缩获得了Lf。盐析法比色谱法简单，易于操作，且成本较低，但此方法得率低，产品纯度不高。但适用于保健品和食品添加剂等纯度要求不高的行业。

2 超滤法

根据膜孔径不同来实现不同分子质量和形状的大分子的分离。日本学者岛崎敬选用孔径分别为l0PS、30PS、50PS、l00PS、300PS、1000PS和3000PS的七种系列超滤膜膜，以干酪乳清为原料，先截留小分子量，再截留大分子量，其分子量分别为104、3×104、5×104、105、3×105、106、3×106，生产Lf基料的回收率为69%。卢蓉蓉等[3]用超滤法从初乳中初步分离得质量分数为26%的Lf粗品，虽适合大规模生产，但还无法提取高纯度的Lf。为强化传质和分离过程，Brisson等[4]在分离过程中添加了一个外加电场强化膜通量，降低膜污染，可用于组分复杂的料液。Ndiaye等[5]用电场强化的超滤膜过滤分离Lf，但其中含有β-乳球蛋白等杂蛋白，产品纯度不高，需进一步纯化。超滤法不加热或不发生相变，适合热敏性组分的分离。操作简便，费用相对较低，易于形成工业化规模，是生产食品用乳铁蛋白最具实现工业化潜力的方法之一。但纯度不如色谱法高，且膜孔堵塞需经常清洗，且不易清洗。

3 离子交换色谱法

3.1 传统离子交换色谱法

根据离子交换剂对不同离子或化合物的结合力不同实现物质分离，结合力的大小由离子交换剂决定。Grove使用DEAE纤维素阴离子交换树脂和磷脂纤维素交换色谱法分离出较纯的Lf。由Foley等[6]用羧甲基阳离子交换色谱法对此法加以改进，用pH值为7.7，浓度为0.05 mol/L磷酸钠或浓度为0.3 mol/L的NaCl洗脱液，把Lf分为a，b两种变异体，纯度为81%左右。树脂可用0.2 mol/LNaOH和0.2 mol/LHCI再生。徐丽萍[8]用Sephadex C-100柱，分别用含0.65 mol/LNaCl7.0，7.2，7.4和7.6的PBS缓冲液洗脱，得纯度为92%Lf。Maharjan等[7]用一种温度敏感型阳离子交换树脂，在50 ℃对Lf的最大吸附容量是20 ℃的3倍，通过调节温度选择性洗脱Lf。传统离子交换树脂虽然成本相对较低，但分辨率也较低，要得到高纯度的Lf需复杂分离工艺。

3.2 新型离子交换法

SPEC70SLS离子交换树脂是丙烯酸共聚合物，由一个AMPS（丙烯酰胺甲基-丙烷磺酸）多聚物和一个双功能试剂MBS（N，N-甲烷-双-丙烯酰胺）交联组成，拥有大孔通透性，能满足大面积表面接触和有效物质传送，实现蛋白的分离纯化，合成树脂可以数千次地重复使用。树脂吸附牛脱脂乳中的Lf可用330 mMNaCl洗脱，吸附容量为8.34 mg/g，纯度为96.7%，树脂对Lf的回收率为74.50%。SPEC70 SLS树脂被美国FDA认可为能与食品接触的物质，在工业化生产规模中具有巨大应用潜力。张振字等[9]采用强阳离子交换色谱梯度洗脱法，对牛乳中的乳铁蛋白进行分离和纯化。可较好地分离提取出乳铁蛋白，并利用SDS—PAGE定测分离出的乳铁蛋白显示为单一区带，每毫升牛乳能提取乳铁蛋白0.23 mg，纯度为95%。

4 亲和色谱法

4.1 传统亲合色谱法

Chen等[10]研究发现PGMA-肝磷脂超顺磁均匀分散微球能够高效的捕获酸乳清中的Lf，吸附量达164 mg/g树脂且纯度高于Lf标准品。亲合色谱法操作简单、分离效果非常好、获得的产品纯度极高，且没有生物活性损失，是生产医药用高纯度Lf最有效的方法之一，但是其操作成本昂贵。限制了其在工业化生产中的广泛应用。

4.2 新型亲和色谱法

一般结构是不容基质…连接物…隔离臂…连接物…配体，基质多用琼脂糖，隔离臂多为有一定长度且可连接基质的有机物如NH2—（CH2）n—NH2。林成招等[11]人用肝素琼脂糖色谱柱，填料为肝素与琼脂糖交联的产物。先用PBS洗脱至吸光值基线平稳后，分别用含0.1，0.3，0.5和1 mol/LNaCl的PBS洗柱，紫外分光光度计测得Lf纯度为90.02%。也可以首先从脱脂乳中萃取到神经节糖苷制成溶血衍生物，共价偶合于丁二酸化玻璃珠上，再利用固定化的神经节基质亲和吸附Lf，最后用缓冲液洗脱。此法可从廉价的乳清中大量制备Lf，方法简单，易于扩大规模可实现工业化。

5 吸附色谱法

利用固定基质和吸附物质问物理或化学吸附强度的不同来分离物质，使用颗粒状吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点，通过范德瓦尔引力和静电引力与蛋白质分子结合，其结合力大小与各种生物分子的结构和吸附剂的性质有关。一般以Toyopearl为基质，在（NH4）2SO4溶液中达到吸附平衡后装柱，用去离子水、0.25 mol/LHAc和0.2 mol/L NaOH洗脱，得到纯度为80%的Lf，其缺点是吸附容量小、效率低。傅维琦等[12]利用CM-SAPHAROSE FastFlow装柱，对脱脂牛初进行两步阶跃洗脱获得高纯度洗脱液，但此法成本较高，大大限制了分离工艺的工业化。

6 固定化单克隆抗体法

利用抗原-抗体之间的高特异性结合反应而实现目标物的分离。在6～8周的鼠腹中注入人或牛的乳铁蛋白进行免疫，经一系列分离出抗体，用抗体和异丙醇活化的亲合凝胶混合制得免疫亲合色谱。用脱脂牛初乳或常乳作为料液，用洗脱0.2 mol/LpH2.7醋酸缓冲液（含0.15 mol/LNaCI）洗脱，分离脱脂人初乳Lf纯度98%，分离脱脂牛乳Lf纯度97%。该法较成功的实现了Lf的一步分离，分离效果好纯度高，抗体被固定可重复使用，但是柱的制备工艺复杂，抗体成本昂贵，难以工业化生产。

7 混合模式扩张床吸附法

功能配基含有疏水和离子交换基团，兼具疏水和静电作用，通过静电相吸强化吸附或静电排斥协助解吸。同时配基密度比较高，有典型的耐盐吸附性，可以从较低浓度的体系中富集目标蛋白。将扩张床吸附和混合模式吸附层析有机结合充分发挥二者优势，实现混合模式扩张床吸附，达到低原料、高处理量和高选择性的分离目标。林东强等[14]采用混合模式扩张床吸附介质Streamline Direct HST的扩张床膨胀特性和流体混合性能好，膨胀率为2满足高处理量和床层稳定性的要求，该介质对Lf的吸附容量较大约为110 mg/g介质，具有一定的耐盐特性，采用pH值阶跃洗脱，20 mmol/LNaOH洗脱直接从牛乳清中得到Lf收率为87.8%。

8 各种分离技术综合运用

蒋超等[15]采用超滤、阳离子交换层析方法从干酪乳清中分离纯化乳铁蛋白。经预处理后的干酪乳清加入经过磷酸盐缓冲液（pH值为8.0）平衡的树脂中，分别用0.3 mol/L和0.8 mol/L的Nacl进行阶跃洗脱，纯度达93.6%。纪长谨等[16]试验通过等电沉淀、盐析和层析分离等方法从牛初乳中分离Lf，并用SDS-PAGE、Western Blot检测和鉴定，Lf其纯度>90%，方法简便、经济、安全，可用于工业化生产。

高纯度和高效的蛋白分离纯化需各种分离技术的结合，许多具体问题有待解决。总之随着高新技术的广泛应用，能够实现降低Lf的制造成本，完善工业化大规模生产和高效性的商品化工艺条件。

参考文献

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[3] 卢蓉蓉，方民.预分离初乳中乳铁蛋白的超滤工艺[J].食品与生物技术，2002（1）：67-70.

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