土壤中产天然维生素E真菌新资源的筛选

摘要：采用稀释平板分离法获得67株真菌，测定其维生素E（VE）含量，以期从土壤中筛选出富含天然VE的真菌新资源。采用高效液相色谱法进行VE含量检测，其中有10株真菌能产生天然VE；通过形态与分子系统学手段对10株菌株进行鉴定，有5株菌株鉴定到种，分别属于马昆德拟青霉（Paecilomyces marquandii）、爪哇棒束孢（Isaria javanica）和淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum），2株菌株鉴定到属，均为戴氏霉属（Taifanglania）；另外3株菌株序列未测出。对其中两株VE含量较高的菌株——马昆德拟青霉和爪哇棒束孢从碳源和氮源方面进行了初步的培养基优化，结果表明不同的碳源、氮源对VE含量均有一定影响。

关键词：真菌；新资源；筛选；天然维生素E；土壤

中图分类号：S182；Q939.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）17-4066-03

Screening of New Resources of Natural Vitamin E Producing Fungi from Soil

ZHANG Yan-wei1，HAN Yan-feng2，LIU Xun1，LIANG Zong-qi2

（1.School of Chemistry and Life Sciences， Guizhou Normal College， Guiyang 550018，China；

2.Institute of Fungus Resources，College of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Abstract： 67 fungal strains were obtained by dilution plate； and their natural vitamin E content was determined by fluorescence spectrophotometry and HPLC to screen new resources of natural vitamin E producing fungi. 10 strains were identified as vitamin E producing fungi. According to morphology and molecular systematics， 5 strains were identified as Paecilomyces marquandii， Isaria javanica， Purpureocillium lilacinum； 2 strains belonged to Taifanglania genus； and 3 strains was not able to be sequenced. The carbon and nitrogen sources of medium for two high vitamin E producing strains， P. marquandii and I. javanica， was optimized； and results showed that different nitrogen and carbon sources affected their vitamin E content to a certain degree.

Key words： fungi； new resources； screen； natural vitamin E； soil

收稿日期：2013-04-18

基金项目：贵州省教育厅自然科学基金项目（2008059）

作者简介：张延威（1979-），男，山西山阴人，副教授，在读博士研究生，研究方向为真菌资源与应用，（电话）0851-5816647（电子信箱）

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维生素E（Vitamin E，VE）又称生育酚， 通常为淡黄色油状，为脂溶性物质；在无氧或氧化剂存在时对热、酸、碱一般稳定，反之则氧化成醌类；对可见光稳定，但可被紫外光破坏。VE是生育酚（Tocopherol）、生育三烯酚（Tocotrienol）及其能够或多或少地显示D-α-生育酚生物活性的一类衍生物的总称，常见的有4种，即α、β、γ和δ-生育酚，其生理作用类似，其中以α-生育酚生理活性最高[1，2]。它在人体内不能自行合成，必须从外界摄取。VE是一种很强的抗氧化剂，在体内可阻止自由基反应的进行，延缓机体衰老，维持生育功能，调节机体的免疫系统，能将某些恶性肿瘤细胞逆转为正常表现形的细胞，还具有维持结缔组织弹性、促进血液循环等功能[3-8]。

VE有两种来源，即天然VE和合成VE。天然VE在结构上纯度较高，生理活性较强，生物利用度较好，更易于被人体吸收，且具有更高的安全性。因此，一般在涉及医药、食品添加剂、营养剂、保健品、化妆品等方面更倾向于使用天然VE；合成VE则主要应用于饲料添加剂等方面[9-11]。由于天然VE的特点及人们对天然绿色产品的青睐，天然VE的市场需求逐年增长，尤其在药品类和保健品类天然VE越来越受到关注[12]。

天然VE广泛分布于动植物组织中，主要来源是植物油及油脂加工产物脱臭馏出物中[13-15]。目前工业生产上，国内外主要以植物油精炼加工时所得脱臭馏出物和残渣（渣油）为原料来提取[16，17]，由于生产原料来源有限，尤其是国内其生产受到了制约[18]。如要更广泛地开发利用天然VE，新的天然VE来源显得尤为重要。真菌易培养、生长周期短，可在短时间内大量生产且不破坏自然资源，在生产应用上有明显优势。关于产天然VE真菌有文献报道的很少，主要是几种虫生拟青霉类真菌[19，20]，土壤真菌也有，但含量很低[21]。土壤是真菌类群非常丰富的基质，故本研究拟从土壤中筛选高产VE的真菌新资源，为天然VE的开发利用提供一条新来源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 供试菌株是从不同地区采集的土壤中分离纯化得到的真菌菌株，共67株，编号为MF1-MF67。

1.1.2 仪器与试剂 所用仪器有Agilent1100高效液相色谱仪、Agilent荧光分光光度计。所用试剂有甲醇、石油醚、抗坏血酸、KOH，均为国产分析纯，VE标准品购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 待测菌株的培养 ①测定VE菌株的培养。将待测菌株接种于PDA液体培养基中摇瓶培养15 d，取出菌丝，用滤纸吸干水分，待测。②测序菌株的培养。将待测菌株接种于PDA固体培养基恒温培养10 d，收集菌丝，待测。

1.2.2 VE的测定方法

1）高效液相色谱仪测定。精确称取新鲜菌丝样品0.5 g，烘干后用研钵粉碎，加入无水甲醇5 mL超声30 min，0.45 μm滤膜微滤后进样检测，检测结果为样品重复检测3次的均值。

色谱检测条件：Hypersil ODS2色谱柱 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶水=98∶2；流速1.0 mL/min；检测器为紫外检测仪，波长292 nm；柱温30 ℃；进样阀体积20 μL。

2）荧光分光光度计测定。精确称取新鲜菌丝样品1.0 g，加入5%（质量分数）的抗坏血酸水溶液5 mL，10 mol/L的KOH溶液5 mL，在水浴中加热并振摇，温度控制在70～80 ℃皂化15 min后移出冷却，加去离子水定容到25 mL，用石油醚40 mL分3次萃取，合并萃取液，用去离子水洗涤萃取液至中性，于旋转蒸发仪中蒸干，用甲醇溶解剩下固体并定容至10 mL，过0.45 μm滤膜微滤后上样检测。同时称取等量菌丝样品，烘干后再次称量，计算样品水分率。将检测结果折算为菌丝干重含量， 结果为样品重复检测3次的均值。

荧光检测条件：激发波长为295 nm，检测波长为330 nm，空白对照为甲醇。

1.2.3 菌株rDNA序列的测定与分析 将收集好的待测菌丝用DNA提取试剂盒提取其总DNA，用ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGTGAGAGATTTCTGTGC-3′）引物进行PCR扩增，扩增产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。

将菌株序列与从GenBank上blast后下载的相关序列用CLUSTAL 1.83进行序列比对，然后用MEGA 5.05中的最大简约法（MP），经1 000次Bootstrap验证，构建系统发育树。

1.2.4 培养基成分对菌株VE含量的影响 以PDA培养基为基本培养基（CK），分别添加不同的碳源、氮源，比较添加了不同成分的培养基对菌株产VE量的影响。添加的碳源、氮源见表1。

2 结果与分析

2.1 菌株VE检测结果

对获得的67株真菌菌株摇瓶培养后收集菌丝，经高效液相色谱法检测，其中有10株菌株含有VE（表2）。

2.2 产VE真菌菌株的鉴定

对以上10株菌株用察氏培养基培养，进行形态学鉴定。同时通过MEGA 5.05软件MP法构建的系统发育树进行验证，结果见图1。其中5株菌株已鉴定到种，即MF31为马昆德拟青霉（Paecilomyces marquandii）；MF32在系统树中与爪哇棒束孢（Isaria javanica）和玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）聚为一类，不能区分，结合其形态特征中的孢子特征，确定为爪哇棒束孢；MF33、MF34和MF40 均为淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）。菌株MF24、MF30和MF65序列未测出，根据菌株形态特征不能确定其归属。菌株MF25和 MF27从形态特征和系统树聚类结果表明属于戴氏霉属（Taifanglania），具体属何种戴氏霉有待进一步鉴定。

2.3 培养基成分对菌株VE含量的影响

选取VE含量高且在摇瓶培养中菌丝量大、生长快的菌株进行试验。根据表2检测结果及菌株在摇瓶培养中菌丝生长情况，选取MF31和MF32两株菌株按照表1添加不同的碳源和氮源，分组摇瓶培养，用荧光分光光度计检测其菌丝干重VE含量，结果如表3所示。培养基中加尿素后两菌株均不能生长，故表中无尿素数据。由表3可以看出，PDA培养基（CK）培养后，MF32的干菌丝VE含量明显高于MF31，当培养基中添加不同碳源、氮源后对两菌株菌丝的VE含量有明显影响。对于MF31，添加两种碳源后其菌丝VE含量降低，尤其是添加甘露糖后，其VE含量仅为对照的1/5；而添加两种氮源后，其菌丝VE含量明显升高。对于MF32，两种碳源对其菌丝VE含量影响不是很明显，而添加两种氮源后，其菌丝VE含量明显下降。

3 讨论

从67株真菌菌株中检测出有10株菌株产VE，检出率为14.93%，可见在土壤中产VE的真菌数量并不少，从土壤中寻找新的天然VE资源是可行的。在培养基成分试验中，VE含量最高可达1 167.88 μg/g（DW）。而该试验仅是从碳源和氮源方面做了初步的探究，相信通过进一步优化培养条件或采用诱变等其他技术手段，其VE含量还有提高的可能，可见从土壤中筛选出具有生产应用价值菌株的可能性是有的。

在培养基成分对菌株VE含量的影响的试验中，VE检测采用的是荧光分光光度计测定法。其原理是VE中的α-生育酚的分子结构中具有苯环，因此具有荧光，且其荧光强度与样品中VE含量呈正比[22]。由于VE是一类衍生物的总称，每种同系物的激发波长和发射波长的荧光强度不相同，用固定的激发波长和发射波长所测定的值与VE总含量的真实值之间是有误差的。在本试验中测出的VE含量实际上是α-生育酚的含量，加之样品经过皂化VE含量会有损失，故其VE总含量应该更高。

综上所述，可知从土壤中寻找新的天然VE资源是一条值得考虑的途径。

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